[發明專利]未經處理的核酸樣本的直接量化

有效

• 申請號: 201480056726.5
• 申請日: 2014-09-15
• 公開（公告）號: CN105637100B
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發明（設計）人: J·Y·劉
• 申請（專利權）人: 生命技術公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/686
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 李程達

本文公開一種用于對未經處理的法醫個案樣本進行直接qPCR量化的工作流程。已經通過由紙質襯底的直接擴增檢測到13pg的DNA。對未經處理的法醫個案樣本進行直接qPCR量化和對在相同PE拭子上收集的未經處理的法醫個案樣本進行直接STR擴增將極大地增加法醫實驗室的效率和能力。

背景技術

對DNA技術用于解決案件的能力的認可增加已經顯著增加對DNA分析的需求。過去僅在暴力犯罪(如他殺和性侵犯)中收集DNA證據的執法機構已經開始收集來自財產犯罪案件的DNA證據來輔助其偵查。然而，來自財產犯罪的生物學證據樣本大多是觸碰DNA樣本。不同于血液或唾液污漬，觸碰DNA并非總是可由肉眼識別的。在許多情況下，執法人員在犯罪現場用拭子擦拭其認為已由作案者觸碰的表面或收集其認為曾與作案者物理接觸的證物。因此，可理解，以這種方式收集的一些樣本可能完全不含有任何DNA。即使當在拭子上收集作案者DNA時，無法保證其將含有足以獲得可提供證據的DNA圖譜的DNA。

取決于犯罪性質，法醫案件可以包括多個血液、唾液污漬以及觸碰DNA樣本。盡管短串聯重復(short tandem repeat；STR)DNA圖譜分析技術極強大，但其對處理個案樣本也是昂貴、費時并且勞動密集的。對不含有足夠DNA的樣本進行完整STR DNA分型分析是對已經有限的法醫實驗室資源的巨大浪費。

法醫樣本的實時聚合酶鏈反應(real-time polymerase chain reaction；rtPCR)量化原先包括于DNA圖譜工作流程中以確保在DNA圖譜分析中所采用的多重PCR中使用最佳量的DNA。最先進的可供使用的實時量化分析還提供關于性別、男性/女性DNA量比率、預期的可能PCR抑制程度和DNA降解水準的信息。rtPCR量化分析的極端敏感性還允許識別不具有足以用于DNA圖譜分析的DNA的樣本。

可供使用的實時量化分析輸入的是假定DNA樣本的等分試樣，所述DNA樣本已經進行過提取和純化程序。這些程序限制實時量化分析作為篩選工具的任何價值，因為當準備好將樣本用于實時量化分析時，大量時間和資源已經耗費在提取和純化樣本上，其可能不具有任何可提供證據的價值。

因此，在本發明之前，所屬領域中需要能夠識別將可提供證據的樣本的簡單、快速、便宜并且穩健的分析。本發明傳授用于在不需要先前提取和純化的情況下分析樣本可提供證據的價值的方法。這些傳授內容代表法醫科學的顯著進步。

發明內容

DNA量化在法醫DNA分析所有應用中起中心作用。法醫DNA分析常常涉及同時分析存在于核DNA中的多個STR。在許多情況下，這通過利用多重聚合酶鏈反應(PolymeraseChain Reaction；PCR)來實現。多STR的平衡擴增允許極不連續的輸入DNA濃度窗，因此潛在說明在STR擴增之前進行DNA量化的重要性。

在本發明之前，用于量化分析中的輸入DNA使用多種方法從其來源中進行提取。這些方法包括提取、苯酚/氯仿、二氧化硅膜、二氧化硅涂布的珠粒、離子交換膜以及具有離子表面的磁珠。使用這類方法的問題包括DNA樣本損失和其是費力的。

本文公開一種用于在不先前應用提取技術的情況下對核酸的存在進行直接量化的方法，所述方法涵蓋將固體載體存放到容器中，在所述容器內進行PCR以及檢測從所述容器發射的熒光水準，其中所述熒光水準通過電荷耦合裝置(Charge-coupled Device；CCD)來加以檢測。在一些實施例中，固體載體是紙張。在一些實施例中，固體載體是濾紙。

在一些實施例中，PCR是兩步PCR，其中粘接和延伸溫度相同。

附圖說明

圖1展示5mm PE拭子。

圖2展示拆開的5mm PE拭子，其顯示三個PE拭子部件；濾紙條、固定器和夾子，以及使用Harris Uni-Core^TM沖孔器(punch)從PE拭子的取樣面積產生的兩個2mm沖孔。