[發(fā)明專利]用于制備DNA文庫的DNA接頭分子以及生產它們的方法和用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480053727.4
• 申請日: 2014-09-29
• 公開（公告）號: CN105579592B
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發(fā)明（設計）人: 彼得·黑恩;亞歷山大·阿扎維;彼得·格呂內費爾德
• 申請（專利權）人: 凱杰有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6806
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 楊青;緱正煜

本發(fā)明涉及用于制備DNA文庫的DNA接頭分子以及生產它們的方法和它們的用途。本發(fā)明可用于分子生物學中的應用，特別是用于下一代測序(Next Generation Sequencing)和/或文庫復用(Library Multiplexing)。本發(fā)明公開了包含雙鏈多核苷酸分子的DNA接頭分子，其中第一鏈的5’末端被修飾成使得沒有用于激酶的結合位點，所述第一鏈的3’末端被修飾成不能發(fā)生連接，反向鏈的5’末端被修飾成使得沒有用于激酶的結合位點，并且所述反向鏈的3’末端以游離羥基為特點(在最后一個核苷酸的3’位置處)。

技術領域

本發(fā)明涉及用于制備DNA文庫的DNA接頭分子以及生產它們的方法和它們的用途。本發(fā)明可用于分子生物學中的應用，特別是用于下一代測序(Next GenerationSequencing)和/或文庫復用(Library Multiplexing)。

背景技術

下一代測序(NGS)是用于確定DNA或RNA序列的核堿基序列的現(xiàn)代技術。NGS的優(yōu)點(速度、經濟效益、準確性)導致它在應對遺傳信息的分析及其執(zhí)行的所有學術機構中的占有率不斷增長。幾個全球性公司提供NGS解決方案，包括Roche、Life Technologies和Illumina。

為了在一次運行中對大量樣品進行測序，可以將已知序列的條形碼添加到確定樣品并用于在測序后將序列指派到樣品。

用于多路測序(同時對大量不同樣品進行測序)的方法、組合物和試劑盒公開在WO2011156529 A2中。在一個反應室中對來自于兩個或更多不同樣品的多個靶多核苷酸進行測序并且通過條形碼鑒定每個被測序的靶多核苷酸所源自的樣品。

另一份公開了具有提高的樣品通量的測序方法的文獻是WO 2008061193 A2。其中將接頭序列(被稱為標簽序列)連接到樣品，隨后將樣品混合并測序。

WO 2013033721 A1公開了為多路DNA測序優(yōu)化條形碼設計的方法。

US 2013059762 A1提供了可用于樣品中存在的一種或多種核酸的多路PCR的方法、組合物、試劑盒、系統(tǒng)和裝置。具體來說，提供了各種不同的靶特異性引物，其允許選擇性擴增一個或多個靶序列。因此，在平末端連接反應中將接頭連接到靶序列。

在用于下一代測序(NGS)的DNA文庫的制備期間，在大多數情況下通過物理或化學方法將高分子dsDNA片段化，并將特異性針對測序平臺的接頭序列連接到產生的DNA分子。一般來說，接頭序列含有用于引物的結合位點，并可能含有條形碼序列，其允許在混合物中測序多個帶條形碼的DNA文庫(多路)并隨后將關于相應條形碼的測序信息指派到原始樣品。

在可以進行這種接頭序列與片段的連接之前，必須修復在片段化期間隨機且不可預見地形成的DNA末端。通過聚合酶將突出的3’末端切除并將突出的5’末端填補成雙鏈。隨后，通過激酶將片段的5’末端磷酸化。隨后，將在一側是平末端以允許在那里連接并且在另一側具有3’突出端以避免在那里連接的未磷酸化的DNA接頭，在連接酶幫助下連接到產生的DNA分子。由于未磷酸化的接頭序列的連接不在接頭的5’末端處導致磷酸二酯鍵的形成，因此在連接后在DNA雙鏈中留下缺口，失去的磷酸二酯鍵隨后需要用能夠進行缺口平移的酶封閉。

常用的接頭序列不能被添加到末端修復混合物，這是因為末端修復混合物中的酶將修飾它們，使得連接的方向性丟失，并且將形成接頭二聚體和寡聚體。

發(fā)明目的

本發(fā)明的目的是改良接頭序列以使它們可以在文庫制備開始時已被添加到片段化的DNA。本發(fā)明的另一個目的是避免接頭二聚體和寡聚體的形成。

發(fā)明內容

本發(fā)明公開了DNA接頭分子，其包含雙鏈多核苷酸分子，其中