[發(fā)明專利]用于制備DNA文庫的DNA接頭分子以及生產(chǎn)它們的方法和用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480053727.4
• 申請日: 2014-09-29
• 公開（公告）號: CN105579592B
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發(fā)明（設計）人: 彼得·黑恩;亞歷山大·阿扎維;彼得·格呂內費爾德
• 申請（專利權）人: 凱杰有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6806
• 代理公司: 中原信達知識產(chǎn)權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 楊青;緱正煜

1.一種DNA接頭分子，其包含雙鏈分子，其中

a.第一鏈的5’末端被修飾成使得第一核苷酸不含游離羥基并且在5’位置處沒有游離磷酸基團，

b.所述第一鏈的3’末端被修飾成使得最后一個核苷酸在3’位置處不含游離羥基，

c.反向鏈的5’末端被修飾成使得第一核苷酸不含游離羥基并且在5’位置處沒有游離磷酸基團，

d.所述反向鏈的3’末端以游離羥基為特點，

其中兩條鏈的5’末端處和第一鏈的3’末端處的羥基被酯化或醚化。

2.權利要求1的DNA接頭分子，其含有條形碼序列以及用于擴增引物和測序引物的結合位點。

3.權利要求1的DNA接頭分子，其特征在于它具有20至90個堿基對的長度。

4.權利要求1的DNA接頭分子，其特征在于它具有40至70個堿基對的長度。

5.權利要求1的DNA接頭分子，其特征在于它具有40至60個堿基對的長度。

6.權利要求1至5任一項的DNA接頭分子，其特征在于通過附連5’-C3間隔基或5’-D間隔基對所述反向鏈的5’末端進行修飾。

7.權利要求1至5任一項的DNA接頭分子，其特征在于通過附連5’-C3間隔基或5’-O-甲基脫氧核苷酸對所述第一鏈的5’末端進行修飾。

8.權利要求1至5任一項的DNA接頭分子，其特征在于通過3’-C3間隔基或3’-氨基修飾物對所述第一鏈的3’末端進行修飾。

9.一種用于生產(chǎn)DNA接頭分子的方法，所述DNA接頭分子包含雙鏈分子，所述方法具有下列步驟：

a.修飾第一鏈的5’末端，使得沒有游離羥基和游離磷酸基團可用，

b.修飾所述第一鏈的3’末端，使得沒有游離羥基可用，

c.修飾反向鏈的5’末端，使得沒有游離羥基和游離磷酸基團可用，

其中兩條鏈的5’末端處和第一鏈的3’末端處的羥基被酯化或醚化。

10.權利要求9的用于生產(chǎn)DNA接頭分子的方法，其中所述第一鏈的5’末端的修飾通過附連5’-O-甲基脫氧胸苷一磷酸或5’-C3間隔基來實現(xiàn)。

11.權利要求9或10的用于生產(chǎn)DNA接頭分子的方法，其中所述第一鏈的3’末端的修飾通過附連3’-C3間隔基或3’-氨基修飾物來實現(xiàn)。

12.權利要求9或10的用于生產(chǎn)DNA接頭分子的方法，其中所述反向鏈的5’末端的修飾通過附連5’-C3間隔基或5’-D間隔基來實現(xiàn)。

13.一種產(chǎn)生DNA文庫的方法，所述方法包括下列步驟：

1)雙鏈DNA的片段化，

2)片段化的雙鏈DNA的末端修復，

3)所述片段化的雙鏈DNA的5’末端的磷酸化，

4)將權利要求1至8任一項的DNA接頭分子與片段化的、末端修復且5’磷酸化的雙鏈DNA連接，其中在步驟2之前添加權利要求1至8任一項的DNA接頭分子。

14.權利要求13的產(chǎn)生DNA文庫的方法，其中所述雙鏈DNA的片段化通過物理或化學或酶學方法或其組合來進行。

15.權利要求13的產(chǎn)生DNA文庫的方法，其中所述片段化的雙鏈DNA的末端修復在具有3’→5’核酸外切酶和5’→3’聚合酶活性的DNA聚合酶的幫助下進行。

16.權利要求15的產(chǎn)生DNA文庫的方法，其中所述DNA聚合酶為T4-DNA聚合酶。