[發明專利]新抗體純化方法和由該方法得到的抗體、以及使用了陽離子交換基團的新抗體純化法和由該方法得到的抗體

在審

• 申請號: 201480051360.2
• 申請日: 2014-09-16
• 公開（公告）號: CN105555795A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 水口和信
• 申請（專利權）人: 株式會社鐘化
• 主分類號: C07K1/18
• 分類號: C07K1/18;C07K1/22;C07K16/00
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 沈雪

技術領域

本發明(第一方式)是將具有用于特異性純化靶分子(例如，抗體或源自抗 體的物質。以下有時將它們總稱為抗體等)的親和配體的載體和具有陽離子 交換基團的載體作為整體來使用而對抗體等進行純化的方法，本發明涉及在 一個色譜步驟中實施親和色譜純化和陽離子交換色譜純化的新抗體純化方 法及由該方法得到的抗體。

另外，本發明(第二方式)是使用了陽離子交換基團(以下也稱為具有陽離 子交換基團的載體、陽離子交換載體)的抗體等(抗體或源自抗體的物質)的新 純化法，本發明涉及pH4.0以下的抗體等的純化方法及由該方法得到的抗 體，但作為以羧基為配體的陽離子交換載體的使用pH，通常不會選擇pH4.0 以下。

背景技術

作為以抗體為主藥的抗體醫藥品的主要成分的單克隆抗體，主要使用哺 乳類培養細胞等以重組蛋白質的形式在培養液中表達，通過多步色譜、膜工 序純化至高純度，然后進行制劑。抗體醫藥品為免疫球蛋白G及其類似物， 一般而言除了稱為抗體的分子以外，還含有由作為免疫球蛋白分子的恒定區 的Fc區與其它功能性蛋白質或肽融合而成的Fc融合蛋白質(含有Fc的分 子)。而且還包含Fab、scFv、以及雙抗體(diabody)等低分子化抗體。另外， 這些抗體醫藥品還包含以微生物為宿主，在其培養上清液中分泌表達的醫藥 品、在菌體內或菌體外壁和菌體細胞膜之間蓄積表達、純化、制劑化的醫藥 品。

該培養、純化、制劑化的工序中所形成或殘留的凝聚體(二聚體以上的 多聚體)成為副作用的主要原因，因此，降低其含量成為抗體醫藥品生產的 重要課題。在此，所謂單體，例如在抗體的情況下，將四聚體結構的抗體定 義為1個分子單位，所述四聚體結構的抗體具有下述構成：由作為恒定區的 Fc區和可變區構成的重鏈(H鏈)2分子以及由可變區域構成的輕鏈(L鏈)2分 子構成。該單位分子的多聚體形成凝聚體，成為抗體醫藥品的副作用的主要 原因。

在培養、純化、制劑化的工序中通過使用復雜的管理方法及添加劑來嘗 試了對抑制凝聚體的生成及其除去進行控制。特別是在純化工序中，除了抑 制凝聚體的生成以外，將其除去也很重要。因此，在純化工序中，要求開發 一種簡便且有效的凝聚體除去技術。

抗體醫藥品的純化工序中，利用特定單元操作的組合進行的純化方法的 模板化(平臺化)不斷發展，在其初期純化工序(回收工序)中，廣泛利用將作 為配體的蛋白質A固定化于水不溶性載體而成的抗體親和分離基質(蛋白質 A載體)。一般而言，使用在中性條件下使抗體吸附于蛋白質A載體，并在 酸性條件下洗脫抗體的方法，但通常通過3步色譜純化而使其高純度化，在 蛋白質A色譜工序的后段，可以通過離子交換色譜、疏水性相互作用色譜 等的組合來除去凝聚體等雜質(非專利文獻1、非專利文獻2、非專利文獻3、 專利文獻5)。

親和配體具有與特定分子特異性結合的功能，將該配體固定化于水不溶 性載體而形成的親和分離基質(也稱為親和色譜載體、親和載體)用于從含有 生物體成分、重組體的微生物和哺乳類培養細胞中有效地分離純化有用物 質。作為實際工業上利用的抗體親和配體，例如可以舉出：由蛋白質A、蛋 白G、蛋白L等源自微生物或使它們重組表達而得到的功能性修飾體(類似 物)構成的肽性或蛋白質性配體、駱駝單鏈抗體(ラクダー一本鎖)或抗體的Fc 受體等重組蛋白質性配體、及噻唑衍生物等化學合成性配體，可以用于抗體 醫藥品等的純化。抗體醫藥品相對于化學藥品顯示更低的毒性且顯示更高的 特異性，因此，作為理想的醫藥品，其需求不斷增高。

對于利用親和載體的分離純化而言，其課題在于抗體的凝聚體、源自宿 主的雜質、抗體的分解物等(以下稱為凝聚體等)的除去。

例如，作為親和載體的一個例子，在蛋白質A色譜工序中，通常進行酸 性洗脫，但是由于各種抗體的洗脫pH不同需要時間進行工藝設計，另外洗 脫pH越低，形成凝聚體的風險越高，因此，對蛋白質A配體進行了施加蛋 白質工程學修飾的嘗試，使得需要pH3左右的較低pH洗脫的抗體也能夠在 pH3.5～4左右洗脫(專利文獻1)。

另外，蛋白質A色譜工序后凝聚體含量較多的情況下，在后段的雜質除 去工序中會導致目標單體(monomer)的收率降低，因此，除了嘗試抑制蛋白 質A色譜工序中的凝聚體形成以外，還進一步嘗試了除去該色譜工序中的 凝聚體。