[發明專利]多重RNA向導的基因組工程

在審

• 申請號: 201480048643.1
• 申請日: 2014-07-08
• 公開（公告）號: CN105518144A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發明（設計）人: 喬治·M·丘奇;詹姆士·迪卡洛
• 申請（專利權）人: 哈佛大學校長及研究員協會
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/10;C12N15/09
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 張英;宮傳芝

相關申請數據

本申請要求于2013年7月9日提交的美國臨時專利申請號61/844,168的優先權，并 且將其全部內容通過引證合并于此用于所有目的。

政府利益的聲明

本發明是根據能源部的DE-FG02-02ER63445、國家科學基金會的NSF-SynBERC以及 國家科學基金會的SA5283-11210的政府支持下完成的。政府對本發明具有一定的權利。

背景技術

細菌和古細菌CRISPR-Cas體系(system)憑借短的向導RNA形成Cas蛋白復合物以 指導存在于侵入的外來核酸內的互補序列的降解。參見Deltcheva，E.etal.CRISPRRNA maturationbytrans-encodedsmallRNAandhostfactorRNaseIII.Nature471， 602-607(2011)；Gasiunas,G，Barrangou,R.，Horvath,P.&Siksnys,V.Cas9-crRNA ribonucleoproteincomplexmediatesspecificDNAcleavageforadaptive immunityinbacteria.proceedingsoftheNationalAcademyofSciences109, E2579-2586(2012)；Jinek,M.etal.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNA endonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science337,816-821(2012)； Sapranauskas,R.etal.TheStreptococcusthermophilusCRISPR/Cassystem providesimmunityinEscherichiacoli.Nucleicacidsresearch39,9275-9282 (2011)；以及Bhaya,D.,Davison,M.&Barrangou,R.CRISPR-Cassystemsinbacteriaand archaea:versatilesmallRNAsforadaptivedefenseandregulation.Annual reviewofgenetics45,273-297(2011)。最近化膿性鏈球菌(S.pyogenes)II型CRISPR體 系的體外重構(reconstitution)證實了融合至正常反式編碼的tracrRNA(“反式激活的 CRISPRRNA”)的crRNA(“CRISPRRNA”)足以指導Cas9蛋白序列特異地切割匹配該crRNA的 靶DNA序列。表達與靶位點同源的gRNA導致Cas9募集(recruitment)和靶DNA的降解。參見 H.Deveauetal.,PhageresponsetoCRISPR-encodedresistanceinStreptococcus thermophilus.JournalofBacteriology190,1390(Feb,2008)。

發明內容

本公開內容的方面旨在使用一種或多種x向導RNA(核糖核酸)多重修飾在細胞中 的DNA以指導由細胞表達的具有核酸酶活性的酶，如具有核酸酶活性的DNA結合蛋白，至該 DNA(脫氧核糖核酸)上的靶位置(targetlocation)，其中，該酶剪切DNA并且使外源供體核 酸插入至該DNA中，如通過同源重組。本公開內容的方面包括在細胞上循環或者重復DNA修 飾步驟以生成在細胞內具有多重DNA修飾(modification)的細胞。修飾可以包括外源供體 核酸的插入。

通過引入編碼多個RNA以及多個外源供體核酸的核酸至表達酶的細胞，如通過共 轉化(co-transformation)，的單一步驟，可以實現將多重外源核酸插入，其中表達該RNA并 且其中在多個RNA中的每一個向導該酶至DNA的特定位點，該酶剪切DNA并且將多個外源核 酸中的一個插入至在此剪切位點處的DNA。根據這個方面，在單一循環中產生了在細胞中的 DNA的多種改變(alteration)或修飾。