[發(fā)明專利]多重RNA向?qū)У幕蚪M工程

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201480048643.1
• 申請(qǐng)日: 2014-07-08
• 公開（公告）號(hào): CN105518144A
• 公開（公告）日: 2016-04-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 喬治·M·丘奇;詹姆士·迪卡洛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 哈佛大學(xué)校長及研究員協(xié)會(huì)
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N15/10;C12N15/09
• 代理公司: 北京康信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11240
• 代理人: 張英;宮傳芝

1.一種在表達(dá)酶的細(xì)胞中對(duì)靶DNA進(jìn)行多重改變的方法，所述酶同與所述靶DNA互補(bǔ)的 RNA形成共定位復(fù)合物并以位點(diǎn)特異性方式切割所述靶DNA，所述方法包括：

(a)將編碼與所述靶DNA互補(bǔ)的一種或多種RNA的第一外來核酸引入至所述細(xì)胞中，并 且所述第一外來核酸向?qū)雒钢了霭蠨NA，其中所述一種或多種RNA和所述酶是用于所 述靶DNA的共定位復(fù)合物的成員，

將編碼一種或多種供體核酸序列的第二外來核酸引入至所述細(xì)胞中，

其中，表達(dá)所述一種或多種RNA以及所述一種或多種供體核酸序列，

其中，所述一種或多種RNA和所述酶共定位至所述靶DNA，所述酶切割所述靶DNA并且將 所述供體核酸插入至所述靶DNA以在所述細(xì)胞中產(chǎn)生改變的DNA，以及

將步驟(a)重復(fù)多次以在所述細(xì)胞中對(duì)于所述DNA產(chǎn)生多重改變。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述酶是RNA向?qū)У腄NA結(jié)合蛋白。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述酶是Cas9。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞是真核細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞是酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞或者動(dòng)物細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述RNA是約10個(gè)至約500個(gè)之間的核苷酸。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述RNA是約20個(gè)至約100個(gè)之間的核苷酸。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述一種或多種RNA是向?qū)NA。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述一種或多種RNA是tracrRNA-crRNA融合體。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述DNA是基因組DNA、線粒體DNA、病毒DNA、或外 源DNA。

11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過重組將所述一種或多種供體核酸序列插入。

12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過同源重組將所述一種或多種供體核酸序列 插入。

13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述一種或多種RNA和所述一種或多種供體核酸 序列是存在于一種或多種質(zhì)粒上。