[發(fā)明專利]用于3D多尺度顯微術(shù)的具有集成微鏡的微構(gòu)造表面

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480047452.3
• 申請日: 2014-08-27
• 公開（公告）號: CN105556280A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 維爾日勒·尼古拉斯·羅伯特·維亞諾夫;文森特·斯蒂德;詹盧卡·格倫奇;雷米·加朗;讓-巴蒂斯特·西巴里塔
• 申請（專利權(quán)）人: 新加坡國立大學(xué);國家科學(xué)研究中心
• 主分類號: G01N21/03
• 分類號: G01N21/03;G02B21/06;B01L3/00
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 蔡勝有;鄭毅

技術(shù)領(lǐng)域

本公開內(nèi)容涉及：用于容納樣品的裝置，該裝置適于安裝至任何顯微 鏡組合件并且通過單個物鏡對一個或更多個樣品提供橫向照明；該裝置在 光學(xué)/熒光顯微術(shù)，特別是但不僅限于選擇性平面照明顯微術(shù)[Selective PlaneIlluminationMicroscopy，SPIM]中的用途；以及用于制造該裝置的 方法。

背景技術(shù)

光學(xué)顯微術(shù)是基于傳播來自受照射的樣品的光，所述光經(jīng)過一組透 鏡，從而產(chǎn)生所期望的對象的放大的視圖。該基本原理被用于各種顯微術(shù) 中，但是承受著一系列缺點，例如受限的分辨率和降低的圖像清晰度。光 學(xué)顯微術(shù)中的光學(xué)分辨率是由光的散射引起的，并且因此難以分辨小于 250納米的對象。這在z方向(光軸)上甚至更差，其中該限制擴大至500 納米或更大。然而，許多細胞結(jié)構(gòu)和組分常常小于該光學(xué)分辨率極限，而 在分析生物分子的功能和說明細胞過程時確定生物分子(例如蛋白質(zhì))在 其自然環(huán)境中的性質(zhì)是重要的。顯微鏡在生命和材料科學(xué)中的應(yīng)用不斷增 多，并且允許在生理條件下對小的對象進行成像的方法是高度期望的。由 于樣品的尺寸、組織的散射、色素沉著的缺乏以及細胞組分的移動，所以 活體樣品中的分辨率通常低于固定的標(biāo)本的分辨率。

照明技術(shù)例如受激發(fā)射損耗(STED)顯微術(shù)、結(jié)構(gòu)化照明顯微術(shù) (SIM)或基于單分子(SM)的技術(shù)(PALM/STORM)革新了顯微術(shù)， 并且使得所謂的超高分辨率成為可能。雖然這些技術(shù)與傳統(tǒng)的照明方法相 比提供了在空間分辨率方面的明顯的優(yōu)點，但是創(chuàng)建這些圖像需要復(fù)雜的 儀器和數(shù)據(jù)分析。這些技術(shù)對活體生物樣品的深度成像能力不佳。

熒光光片顯微術(shù)已變得日益普及并且更適于對活體細胞進行成像。基 于光片的顯微術(shù)背后的構(gòu)思是，在檢測光器件的焦平面周圍明確限定的體 積內(nèi)，僅從垂直于觀察方向的側(cè)面照射樣品的一個薄層。該技術(shù)不需要使 用強激光，使得其為微創(chuàng)的并且減少光漂白。

在廣泛采用的光片技術(shù)，即選擇性平面照明顯微術(shù)(SPIM)中，圓 柱形光器件或者通過振鏡的掃描用于創(chuàng)建不同厚度的光片，并且能夠適于 不同的樣品尺寸：針對較小的樣品(20微米至100微米)，可以使得光片 非常薄(約1微米)，而針對較大的樣品(1毫米至5毫米)，該片必須更 厚(約5微米至10微米)以保持在整個視場中的相對均勻。

與落射熒光顯微術(shù)(epifluorescencemicroscopy)中所使用的檢測系 統(tǒng)(其中單個物鏡用于照射樣品以及沿相同路徑采集其熒光兩者)相反， SPIM包括：(1)檢測透鏡，所述檢測透鏡水平對齊并且浸沒在填充有流 體的腔內(nèi)，嵌入透明凝膠中并且浸沒在腔介質(zhì)中的樣品從頂部固定；(2) 激發(fā)透鏡，所述激發(fā)透鏡垂直于檢測透鏡的光軸來照射樣品；以及(3) 單個圓柱形透鏡，或者振鏡，所述單個圓柱形透鏡或者振鏡通過激發(fā)透鏡 在腔內(nèi)形成光片。通過沿檢測軸以逐步方式移動樣品來獲取一疊圖像。

雖然熒光光片顯微術(shù)原則上解決了其他技術(shù)遇到的一些限制，但是復(fù) 雜的機器和困難的設(shè)置使得該方法不適于常規(guī)實驗室實踐。如上所述，熒 光光片顯微術(shù)需要將兩個物鏡垂直并且接近樣品放置，這除了獨特的機器 外還需要特殊的樣品保持器，并且阻止了使用高NA物鏡和常規(guī)的蓋玻 片。明顯的是，沒有能夠解決下述問題的最佳解決方案：用由基于SM的 超分辨率顯微術(shù)提供的盡可能最佳的納米級分辨率對整個單細胞進行3D 成像。

本公開內(nèi)容涉及用于容納樣品的裝置，該裝置適于安裝至任何顯微鏡 組合件，并且為裝置中所包含的一個或更多個樣品提供光片顯微術(shù)。裝置 包括樣品孔，其中所述孔的一個或更多個側(cè)面設(shè)置有成角度的反射表面， 所述反射表面適于使光片反射橫向通過樣品，以提供可由單個物鏡檢測的 熒光圖像。通過相同的物鏡來進行光片和熒光采集。所述裝置為與高分辨 率熒光顯微術(shù)關(guān)聯(lián)的前述問題提供了簡化且廉價的解決方案。本公開內(nèi)容 提供了單物鏡SPIM[soSPIM]方法，并且允許由陣列微鏡芯片在標(biāo)準(zhǔn)的倒 置顯微鏡上進行SPIM成像。通過相同且唯一的單個物鏡來進行檢測和激 發(fā)。裝置可以縮放以包括各種尺寸的反射表面(例如，從20微米至2毫 米)，并且在使用合適放大率的物鏡(例如，從100×至10×)的情況下， soSPIM系統(tǒng)允許在相同的儀器上進行3D高分辨率和3D超分辨率的從單 個細胞至整個有機體水平[例如，胚胎成像]的3DSPIM。