[發(fā)明專利]用于3D多尺度顯微術(shù)的具有集成微鏡的微構(gòu)造表面

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480047452.3
• 申請日: 2014-08-27
• 公開（公告）號: CN105556280A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 維爾日勒·尼古拉斯·羅伯特·維亞諾夫;文森特·斯蒂德;詹盧卡·格倫奇;雷米·加朗;讓-巴蒂斯特·西巴里塔
• 申請（專利權(quán)）人: 新加坡國立大學(xué);國家科學(xué)研究中心
• 主分類號: G01N21/03
• 分類號: G01N21/03;G02B21/06;B01L3/00
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 蔡勝有;鄭毅

技術(shù)領(lǐng)域

本公開內(nèi)容涉及：用于容納樣品的裝置，該裝置適于安裝至任何顯微 鏡組合件并且通過單個物鏡對一個或更多個樣品提供橫向照明；該裝置在 光學(xué)/熒光顯微術(shù)，特別是但不僅限于選擇性平面照明顯微術(shù)[Selective PlaneIlluminationMicroscopy，SPIM]中的用途；以及用于制造該裝置的 方法。

背景技術(shù)

光學(xué)顯微術(shù)是基于傳播來自受照射的樣品的光，所述光經(jīng)過一組透 鏡，從而產(chǎn)生所期望的對象的放大的視圖。該基本原理被用于各種顯微術(shù) 中，但是承受著一系列缺點(diǎn)，例如受限的分辨率和降低的圖像清晰度。光 學(xué)顯微術(shù)中的光學(xué)分辨率是由光的散射引起的，并且因此難以分辨小于 250納米的對象。這在z方向(光軸)上甚至更差，其中該限制擴(kuò)大至500 納米或更大。然而，許多細(xì)胞結(jié)構(gòu)和組分常常小于該光學(xué)分辨率極限，而 在分析生物分子的功能和說明細(xì)胞過程時確定生物分子(例如蛋白質(zhì))在 其自然環(huán)境中的性質(zhì)是重要的。顯微鏡在生命和材料科學(xué)中的應(yīng)用不斷增 多，并且允許在生理條件下對小的對象進(jìn)行成像的方法是高度期望的。由 于樣品的尺寸、組織的散射、色素沉著的缺乏以及細(xì)胞組分的移動，所以 活體樣品中的分辨率通常低于固定的標(biāo)本的分辨率。

照明技術(shù)例如受激發(fā)射損耗(STED)顯微術(shù)、結(jié)構(gòu)化照明顯微術(shù) (SIM)或基于單分子(SM)的技術(shù)(PALM/STORM)革新了顯微術(shù)， 并且使得所謂的超高分辨率成為可能。雖然這些技術(shù)與傳統(tǒng)的照明方法相 比提供了在空間分辨率方面的明顯的優(yōu)點(diǎn)，但是創(chuàng)建這些圖像需要復(fù)雜的 儀器和數(shù)據(jù)分析。這些技術(shù)對活體生物樣品的深度成像能力不佳。

熒光光片顯微術(shù)已變得日益普及并且更適于對活體細(xì)胞進(jìn)行成像。基 于光片的顯微術(shù)背后的構(gòu)思是，在檢測光器件的焦平面周圍明確限定的體 積內(nèi)，僅從垂直于觀察方向的側(cè)面照射樣品的一個薄層。該技術(shù)不需要使 用強(qiáng)激光，使得其為微創(chuàng)的并且減少光漂白。

在廣泛采用的光片技術(shù)，即選擇性平面照明顯微術(shù)(SPIM)中，圓 柱形光器件或者通過振鏡的掃描用于創(chuàng)建不同厚度的光片，并且能夠適于 不同的樣品尺寸：針對較小的樣品(20微米至100微米)，可以使得光片 非常薄(約1微米)，而針對較大的樣品(1毫米至5毫米)，該片必須更 厚(約5微米至10微米)以保持在整個視場中的相對均勻。

與落射熒光顯微術(shù)(epifluorescencemicroscopy)中所使用的檢測系 統(tǒng)(其中單個物鏡用于照射樣品以及沿相同路徑采集其熒光兩者)相反， SPIM包括：(1)檢測透鏡，所述檢測透鏡水平對齊并且浸沒在填充有流 體的腔內(nèi)，嵌入透明凝膠中并且浸沒在腔介質(zhì)中的樣品從頂部固定；(2) 激發(fā)透鏡，所述激發(fā)透鏡垂直于檢測透鏡的光軸來照射樣品；以及(3) 單個圓柱形透鏡，或者振鏡，所述單個圓柱形透鏡或者振鏡通過激發(fā)透鏡 在腔內(nèi)形成光片。通過沿檢測軸以逐步方式移動樣品來獲取一疊圖像。

雖然熒光光片顯微術(shù)原則上解決了其他技術(shù)遇到的一些限制，但是復(fù) 雜的機(jī)器和困難的設(shè)置使得該方法不適于常規(guī)實驗室實踐。如上所述，熒 光光片顯微術(shù)需要將兩個物鏡垂直并且接近樣品放置，這除了獨(dú)特的機(jī)器 外還需要特殊的樣品保持器，并且阻止了使用高NA物鏡和常規(guī)的蓋玻 片。明顯的是，沒有能夠解決下述問題的最佳解決方案：用由基于SM的 超分辨率顯微術(shù)提供的盡可能最佳的納米級分辨率對整個單細(xì)胞進(jìn)行3D 成像。

本公開內(nèi)容涉及用于容納樣品的裝置，該裝置適于安裝至任何顯微鏡 組合件，并且為裝置中所包含的一個或更多個樣品提供光片顯微術(shù)。裝置 包括樣品孔，其中所述孔的一個或更多個側(cè)面設(shè)置有成角度的反射表面， 所述反射表面適于使光片反射橫向通過樣品，以提供可由單個物鏡檢測的 熒光圖像。通過相同的物鏡來進(jìn)行光片和熒光采集。所述裝置為與高分辨 率熒光顯微術(shù)關(guān)聯(lián)的前述問題提供了簡化且廉價的解決方案。本公開內(nèi)容 提供了單物鏡SPIM[soSPIM]方法，并且允許由陣列微鏡芯片在標(biāo)準(zhǔn)的倒 置顯微鏡上進(jìn)行SPIM成像。通過相同且唯一的單個物鏡來進(jìn)行檢測和激 發(fā)。裝置可以縮放以包括各種尺寸的反射表面(例如，從20微米至2毫 米)，并且在使用合適放大率的物鏡(例如，從100×至10×)的情況下， soSPIM系統(tǒng)允許在相同的儀器上進(jìn)行3D高分辨率和3D超分辨率的從單 個細(xì)胞至整個有機(jī)體水平[例如，胚胎成像]的3DSPIM。