[發明專利]用于PTH的純化方法

在審

• 申請號: 201480046603.3
• 申請日: 2014-08-21
• 公開（公告）號: CN105473610A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發明（設計）人: 桑吉烏·庫馬爾·門迪拉塔;桑賈伊·班迪奧帕迪亞伊;阿萬尼什·庫馬爾·辛格
• 申請（專利權）人: 卡迪拉保健有限公司
• 主分類號: C07K14/635
• 分類號: C07K14/635
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 沈敬亭;徐麗華

技術領域

本發明提供了用于純化重組甲狀旁腺激素(recombinantparathyroidhormone)(rhPTH^1-34或特立帕肽)的改善方法。根據本發明的純化PTH的方法包括在使用任何陽離子交換色譜(陽離子交換層析，cationexchangechromatography)之前在第一步驟中使用陰離子交換色譜(陰離子交換層析)。這樣的純化方法產生具有大于99％純度的高度純化的rhPTH^1-34，而沒有在純化方法中采用任何HPLC柱步驟。

背景技術

重組人類甲狀旁腺激素(rhPTH^1-34)或特立帕肽(teriparatide)是內源人甲狀旁腺激素(PTH)的生物活性的N-端片段(N-terminalfragment)。在治療上，特立帕肽用于治療具有骨質疏松癥的處于高骨折風險的男人和絕經后的女人。其增加了骨無機鹽密度并且降低了脊椎骨折和非脊椎骨折的風險。

本發明的發明人通過使用基因工程大腸桿菌(E.coli)細胞作為宿主系統的重組DNA技術已經固有地開發了特立帕肽。包含34天然氨基酸的特立帕肽具有4117.8Da的理論分子量。特立帕肽是不含半胱氨酸的多肽鏈。

在人體中，PTH主要通過甲狀旁腺的主細胞作為包含單個多肽鏈的84個氨基酸(9.5kDa)來合成和分泌。在釋放到血流中之后，PTH與主要存在于骨質和腎臟中的特定膜受體結合以維持血清Ca²⁺水平。激素-受體相互作用導致具有典型的級聯系統的cAMP依賴性蛋白激酶A以及鈣依賴性蛋白激酶C信號通路兩者的激活。

在循環中，內源的天然PTH具有2至5分鐘的半衰期并且其大于90％的清除由肝臟和腎臟介導。

已經通過幾種生化和結構的研究觀察到，重組地或合成地生產的PTH的N-端的1-34個氨基酸片段在結合受體中完全保持了活性以及它的活化作用。對于最佳的受體結合活性，發現PTH^1-34多肽鏈的N-端部、1-27個氨基酸對于生物活性是必要的。PTH^1-34的N-端部在結合于它的受體之后引起cAMP的刺激作用，然而PTH^1-34的C-端部幫助提供大部分的結合能量而不導致cAMP的活化。

PTH在Ca²⁺內穩態中發揮重要的作用。當在血液循環中Ca²⁺濃度較低(低血鈣)時，經由質膜結合鈣傳感器由甲狀旁腺細胞觸發PTH的釋放。如果持續低血鈣，那么出現甲狀旁腺的過度生長和增生。在另一方面，通過負反饋機制在血漿中Ca²⁺濃度的升高抑制PTH的釋放。

本發明涉及重組PTH的純化。在現有技術中存在一些已知的純化方法。這樣的純化方法包括使用昂貴的并且在操作期間需要大量有機溶劑的高效液相色譜(HPLC)。高的儀器成本、要求耐火的生產裝置以及要求大量昂貴的優質有機溶劑用作流動相是在由HPLC在工業規模上純化PTH情況中的主要局限性。

WO2009019715公開了用于rhPTH(1-34)的兩步正交純化法，包括陽離子交換色譜可選地接著是選自HIC或RP-HPLC的制備色譜以產生>98％純度的靶蛋白。

WO2003102132涉及用于蛋白純化的方法，包括將非親和色譜與HPTFF組合。

印度申請2991/MUM/2010公開了包括陽離子交換色譜和凝膠過濾色譜的PTH純化方法。

本發明中所描述的用于純化PTH的方法在所述多肽分子的純化方法期間不包括其中將有機溶劑用作流動相的任何柱色譜或任何HPLC柱色譜。因此，本發明公開了簡單的、成本有效的、高度可規模化的(highlyscalable)、工業可行的和環境有利的純化方法以獲得高度純化的rhPTH^1-34。在本發明中公開的純化方法可以用于從通過任何方法產生的包含rhPTH^1-34的粗混合物(crudemixture)中純化PTH。

發明內容

本發明提供了用于純化甲狀旁腺激素(甲狀旁腺素)(PTH)、優選重組PTH的方法。

在一個方面，本發明提供了用于純化PTH、優選重組PTH的非HPLC的方法，包括在含水相中使用多重色譜步驟(multiplechromatographystep)。