[發明專利]減毒流感疫苗和其用途

有效

• 申請號: 201480045309.0
• 申請日: 2014-07-18
• 公開（公告）號: CN105518129B
• 公開（公告）日: 2020-04-28
• 發明（設計）人: 安德魯·考克斯;斯蒂芬·杜赫斯特;約翰·特雷納;貝克·金
• 申請（專利權）人: 羅切斯特大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;A61K39/145;C12N9/12;C12N15/54
• 代理公司: 北京英賽嘉華知識產權代理有限責任公司 11204
• 代理人: 王達佐;洪欣

本文中提供了減毒流感病毒和制造減毒流感病毒的方法。

本申請要求2013年7月19日提交的美國臨時申請號61/856,442的權益，該美國臨時申請的公開內容是以全文引用的方式并入本文中。

關于聯邦資助研究的聲明

本發明是在政府資助下根據國家衛生研究院(NIH)授權號HHSN2662007000008C、NIH授權號T32 GM068411和NIH授權號T32 GM07356來進行。政府享有本發明的某些權利。

背景

流感是以輕度至重度疾病為標志且在一些情況下甚至以死亡為標志的嚴重公共衛生問題。目前的活減毒流感疫苗(LAIV)的減毒程度不足以施用于2歲以下的兒童、孕婦、免疫性受損人士或處在流感并發癥的高風險之下的人士。然而，這些人群處在流感并發癥的高風險之下。

發明概要

本文中提供了一種經修飾的甲型流感病毒，其包含在氨基酸310至325中具有一個或多個突變的PB1聚合酶。還提供了一種編碼甲型流感病毒的PB1聚合酶的重組核酸，其中所述核酸編碼在氨基酸310至325中具有一個或多個突變的PB1聚合酶。還提供了包含本文中所描述的任何甲型流感病毒或包含本文中所描述的任何編碼PB1聚合酶的核酸的細胞群體。聚合酶突變產生溫度敏感性病毒，其中所述病毒具有從約37℃至約39℃(即，在體溫下)減緩的生長。這種減緩的生長潛力在用于誘導免疫反應時有利于提高病毒的安全性。

還提供了一種用于在受試者中引發針對流感病毒的免疫反應的方法，其包括施用有效劑量的本文中所描述的經修飾的甲型流感病毒和藥學上可接受的載體。

還提供了一種用于在受試者中治療或預防流感感染的方法，其包括向已受流感感染或易受流感感染的受試者施用有效劑量的如本文中所描述的經修飾的甲型流感病毒和藥學上可接受的載體。

還提供了一種產生本文中所描述的甲型流感病毒的方法，其包括(a)用一個或多個包含以下各項的載體轉染宿主細胞群體：i)編碼甲型流感病毒的內部基因組節段的核酸序列；和ii)編碼在氨基酸310至325中具有一個或多個突變的PB1聚合酶的核酸；(b)培養所述宿主細胞；和(c)回收經修飾的甲型流感病毒。

還提供了一種用于產生流感免疫原的方法，其包括：(a)用本文中所描述的任何甲型流感病毒感染細胞群體；(b)培養所述細胞；(c)從步驟(b)的培養物中收集所述病毒；和(d)用所收集的病毒制備免疫原。

附圖描述

圖1示出了對在37℃下具有溫度敏感性的PB2單基因置換病毒的鑒定。用單基因置換病毒以0.01的感染復數(MOI)將MDCK細胞感染1h，其中PB2來自于冷傳代A/AnnArbor/6/60，并且所有其他基因都來自于季節性病毒株A/Korea/82。用含鎂和鈣的杜爾貝科氏磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)(Invitrogen)將細胞洗滌一次，然后在34℃、37℃或39℃下在含有0.15％牛血清白蛋白(BSA)和1μg/ml甲苯磺酰基磺酰基苯基丙氨酰基氯甲基酮(TPCK)-胰蛋白酶的DMEM中培養。在所指示的時間點，收集并置換10％培養物上清液，并且通過TCID-50測量來測定病毒效價。

圖2示出了PB1319Q突變顯著降低人類甲型流感病毒RNA聚合酶在37℃下的功能活性。在人類HEK-293FT細胞中通過定量在經PB1、PB2、PA和NP蛋白表達質粒以及表達流感病毒樣RNA構建體的報告質粒轉染的細胞的澄清細胞溶解產物中對螢火蟲熒光素酶的熒光素酶活性來表征所指示的聚合酶的聚合酶活性。在所指示的溫度下孵育細胞。所有測定都利用相同的NP質粒。描繪了螢火蟲發光與海腎發光之比。數據是最少三個獨立實驗的平均值。誤差線表示一個平均標準誤差。這一小基因組測定中所使用的所有質粒都相同，但在殘基319處編碼Q的PB1質粒(如所指示)除外。這些質粒是通過將共有序列從病毒生長曲線克隆到哺乳動物pCAGGS表達載體中而由病毒母液產生。