[發(fā)明專利]用于制備唾液酸衍生物的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201480042946.2
• 申請(qǐng)日: 2014-05-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105473728A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 禹真錫;金秉祺;金大熙;崔允姬;宋在京;姜善燁;徐元敏;梁智英;李尙美
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 基因化學(xué)株式會(huì)社
• 主分類號(hào): C12P19/00
• 分類號(hào): C12P19/00;C07H15/20;C07H15/04;C12N9/10
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務(wù)所 11494
• 代理人: 陳桉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于制備唾液酸衍生物的方法，其特征在于在一個(gè)反應(yīng)器中將從N-乙 酰-D-葡糖胺(GlcNAc)制備CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-NeuAc)的過(guò)程和包含結(jié)合唾液酸與 包含半乳糖的衍生物如乳糖等的唾液酸(神經(jīng)氨酸)衍生物制備過(guò)程一起進(jìn)行。

背景技術(shù)

糖(自然界中最為廣泛和大量存在的一種生物分子)是參與細(xì)胞內(nèi)識(shí)別和信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)的最常見(jiàn)的分子。當(dāng)通過(guò)核酸活化時(shí)，大部分糖組成單元可加至苷元。核苷酸-糖具有單 糖的活化形式，并用作糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的供體。然而，該轉(zhuǎn)糖基作用仍具有糖基轉(zhuǎn)移 酶反應(yīng)性弱、活化多糖組成單元使用受限等問(wèn)題。

近來(lái)，由于針對(duì)糖鏈結(jié)構(gòu)和功能的研究已快速開(kāi)展，包含低聚糖、糖脂、糖蛋白等， 具有生理學(xué)活性的糖鏈作為藥物或功能材料的用途開(kāi)發(fā)已積極開(kāi)展。其中，在末端包含N- 乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)的含唾液酸糖鏈?zhǔn)蔷哂屑?xì)胞粘附重要功能或用作病毒感染受體等的 糖鏈。

含唾液酸糖鏈通常通過(guò)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的催化合成。唾液酸轉(zhuǎn)移酶是使用CMP-N-乙 酰神經(jīng)氨酸作為糖供體，將唾液酸轉(zhuǎn)移至受體例如糖鏈等的酶。然而，事實(shí)上，用作糖供體 的CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸是顯著昂貴的且對(duì)應(yīng)于試劑級(jí)的僅少量供有。

作為制備CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法，使用5'-三磷酸胞苷(CTP)和N-乙酰神經(jīng)氨 酸(NeuAc)作為底物并通過(guò)CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶的合成方法是已知的。然而，因?yàn)? CTP和NeuAc為昂貴原料，所以通過(guò)直接使用原料而合成的CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸也是昂貴 的。

作為制備CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸(CMP-NeuAc)的方法，以下方法已被報(bào)道：(1)使用 N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶或N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶由N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)制備CMP- NeuAc的方法(J.Am.Chem.Soc.，110:6481，1988；J.Am.Chem.Soc.，110:7159，1988；日本專 利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)Hei10-4961)，(2)通過(guò)在堿性條件下將N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)轉(zhuǎn)化為N- 乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)，并往其中加入N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶或N-乙酰神經(jīng)氨酸合成 酶而制備N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)的方法(日本專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)Hei5-211884； Biotechnol.Bioeng.，66:2，1999；EnzymeMicrob.Technol.，20，1997)，(3)使用N-乙酰葡 糖胺(GlcNAc)2-差向異構(gòu)酶將GlcNAc催化轉(zhuǎn)化為ManNAc，并使用N-乙酰神經(jīng)氨酸裂解酶或 N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶以由N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)制備NeuAc的方法(WO95/26399；日 本專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)Hei3-180190；日本專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2001-136982)，(4)使用大腸桿菌和 酵母細(xì)胞合成CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的方法等。

然而，所述方法(1)具有N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)為昂貴原料的問(wèn)題，且所述 方法(2)具有從GlcNAc和N-乙酰-D-甘露糖胺(ManNAc)的混合物純化ManNAc的過(guò)程極度復(fù) 雜的問(wèn)題，即便N-乙酰-D-葡糖胺(GlcNAc)為廉價(jià)原料。此外，因?yàn)榉椒?3)中使用的 GlcNAc2-差向異構(gòu)酶需要ATP(三磷酸腺苷)，所以方法(3)具有需要加入昂貴的ATP或使用 微生物從ATP前體腺嘌呤產(chǎn)生ATP的問(wèn)題。方法(4)具有就過(guò)程而言，大腸桿菌(E.coli)和酵 母細(xì)胞的使用復(fù)雜的問(wèn)題。

韓國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)10-2006-0010706公開(kāi)了用于制備CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的以 下方法：通過(guò)將5’-單磷酸胞苷(CMP)、N-乙酰-D-葡糖胺、丙酮酸鹽(丙酮酸鈉)和酵母加至 引入了包含編碼N-乙酰葡糖胺-2-差向異構(gòu)酶的基因和編碼N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶的基因 的共表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化株以由此合成神經(jīng)氨酸，并進(jìn)一步加入CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶， 或?qū)?’-單磷酸胞苷(CMP)、N-乙酰-D-葡糖胺、丙酮酸鹽和酵母加至引入了包含編碼N-乙酰 神經(jīng)氨酸醛縮酶的基因和編碼CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶的基因的共表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化株。 然而，該方法具有以下問(wèn)題：CMP-N-乙酰神經(jīng)氨酸的制備中需要進(jìn)行各種步驟，且由用作底 物的5’-單磷酸胞苷(CMP)至5'-三磷酸胞苷(CTP)的轉(zhuǎn)化率低。