[發明專利]用于生產單克隆抗體的改進方法

在審

• 申請號: 201480038458.4
• 申請日: 2014-07-07
• 公開（公告）號: CN105431454A
• 公開（公告）日: 2016-03-23
• 發明（設計）人: 桑吉夫·庫瑪·門迪拉塔;桑賈伊·班迪奧帕迪亞伊;桑賈伊·帕特爾
• 申請（專利權）人: 卡迪拉保健有限公司
• 主分類號: C07K16/24
• 分類號: C07K16/24;C07K16/22;C07K16/32;C07K16/28
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 彭鯤鵬;鄭斌

技術領域

本發明涉及用來獲得大量具有期望帶電變體譜(desiredprofileofchargedvariant)之單克隆抗體的改進方法。在一個實施方案中，所述方法還提供了具有期望聚糖譜(desiredprofileofglycan)的抗體。所述方法包括在期望分子的生產期間首先在合適的溫度下培養哺乳動物細胞，接著降低所述溫度，并且任選地同時添加合適的氨基酸。

背景技術

蛋白質是大且復雜的分子。它們必須處于其天然構象(confirmation)以保持生物活性。此外，在高濃度下，溶液中的蛋白質分子在儲存期間易于隨時間而經受聚集或者降解或者某些修飾。一方面，本發明提供了用來獲得增加量的期望品質產物(優選單克隆抗體)的方法。單克隆抗體(mAb)因其與靶抗原結合的高度特異性、引起對靶抗原的免疫應答的能力和長血清持久性而作為治療劑已經獲得明顯關注。有許多針對腫瘤特異性抗原的單克隆抗體。發現每種免疫球蛋白的一些獨特的特性特征(例如，帶電性質和聚糖結構)對作用模式重要和特異。和許多其它蛋白質一樣，單克隆抗體具有優化靜電相互作用以及調節其結構、穩定性、化學和生物性質的電荷異質性。在生產期間，由于降解、修飾或多種酶促過程會發生多種形式的微觀異質性。蛋白質的降解因化學不穩定性或物理不穩定性而發生。化學不穩定性主要可能是脫酰胺作用、外消旋、水解、氧化、β-消除或二硫鍵交換(disulfideexchange)的結果。化學不穩定性導致形成多種帶電變體并因此修飾生物分子的性質。化學修飾(例如脫酰胺作用和唾液酸化)分別導致mAb上的凈負電荷增加和引起pI值的降低。生成酸性變體的其它機理在現有技術中是已知的。脫酰胺同種型(isoform)易于隨活性的喪失而降解，因此其顯著影響單克隆抗體蛋白質的活性和穩定性。

類似地，Fc區中的N-糖基化調節免疫球蛋白和其它含Fc分子的抗體效應物功能。Fc聚糖可包含多種不同類型的影響抗體功能的末端糖。末端半乳糖基化的作用對技術人員來說是已知的。不同免疫球蛋白的半乳糖基化模式示出在該免疫球蛋白中的產物特異性的變化性。重要的是，要注意末端半乳糖基化的變化影響抗體與抗原的結合，以及確實極大地影響分子的CDC活性。另一方面，已知不同程度的半乳糖基化對ADCC活性具有較小的影響，然而無巖藻糖基化對ADCC活性極為重要。

本領域中已知有多種單克隆抗體的生產方法。這些方法包括保持重量滲透摩爾濃度(osmolality)、在降低溫度下添加鹽，等等。

US5705364公開了用于控制位于糖蛋白的寡糖側鏈上之唾液酸的量的細胞培養方法，其通過以下來實現：向培養物添加約0.1mM至約20mM濃度的鏈烷酸(alkanoicacid)或其鹽，保持所述培養物的重量滲透摩爾濃度為約250至約600mOsm，以及保持所述培養物的溫度在約30℃至35℃的溫度。

US5976833提供了一種用于提高通過動物細胞生產有用物質時的生產力的方法。其公開了一種用于動物細胞培養以生產期望物質的方法，包括以下步驟：(1)在所述動物細胞可以生長的溫度下培養動物細胞；以及(2)在較低的溫度下培養動物細胞。

WO2014035475公開了一種用于控制重組表達的蛋白質之寡糖分布的方法，其包括向所述蛋白質的重組表達中所使用的細胞培養基補充酵母水解產物補充物和植物水解產物補充物。其還公開了用于通過調節細胞培養基的天冬酰胺氨基酸濃度來控制抗體之寡糖分布的方法；但是本發明不包括這些水解產物在培養基中的補充。

盡管存在用于生產單克隆抗體的不同方法的可用性，仍然需要建立一種用于生產單克隆抗體的細胞培養方法，其始終生成期望水平的帶電變體譜(chargedvariantprofile)和聚糖譜(glycanprofile)，而無批次之間的任何明顯變化。這種方法也將有助于獲得具有期望電荷譜和/或聚糖譜的單克隆抗體蛋白質。本發明提供了這樣一種使用修改的細胞培養方法生產單克隆抗體的改進方法。根據本發明的方法不包括鹽的添加或合適的重量滲透摩爾濃度的保持。本發明提供了用于生產具有期望聚糖譜和帶電變體譜之單克隆抗體的新方法。

發明內容

本發明提供了用來使用修改的細胞培養方法獲得大量具有期望聚糖譜和帶電變體譜的單克隆抗體的改進方法。

一方面，細胞培養方法的特征在于：在細胞培養過程期間，以立即或逐步方式保持細胞培養生產條件處于多個溫度。