[發(fā)明專利]用于使用N-末端截短的β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶變體的糖蛋白的單-和二唾液酸化的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201480038103.5
• 申請日: 2014-07-03
• 公開（公告）號: CN105358703A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: T.察巴尼;A.恩格爾;M.格里夫;C.容;C.盧利;S.馬利克;R.米勒;B.尼德茨基;D.里比奇;K.施默爾策;H.施瓦布;H.佐貝克;B.蘇普曼;M.托曼;S.齊岑巴赫爾
• 申請（專利權(quán)）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C12P19/18
• 分類號: C12P19/18;C12P21/00;C12N9/10;C07K16/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 梁謀;黃希貴

本公開涉及具有N-末端截短缺失的某些糖基轉(zhuǎn)移酶變體的用途。發(fā)現(xiàn)人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶I(hST6Gal-I)的兩種不同的截短變體的組合表現(xiàn)出不同的唾液酸轉(zhuǎn)移酶比活性。在一個例子中，在其中第一變體?89hST6Gal-I催化雙唾液酸化目標(biāo)分子的形成的條件下，第二變體?108hST6Gal-I催化單唾液酸化目標(biāo)分子的形成。因此，公開了哺乳動物糖基轉(zhuǎn)移酶的變體，編碼其的核酸，用于重組產(chǎn)生哺乳動物糖基轉(zhuǎn)移酶的變體的方法和方式及其用途，特別是用于以定量受控方式唾液酸化作為糖蛋白諸如免疫球蛋白的部分的聚糖部分的末端受體基團的用途。

背景

轉(zhuǎn)移酶(EC2)催化官能團從一種物質(zhì)轉(zhuǎn)移至另一種物質(zhì)。糖基轉(zhuǎn)移酶，酶的一個超家族，參與合成糖蛋白、糖脂和糖胺聚糖的碳水化合物部分。特定糖基轉(zhuǎn)移酶通過將活化的糖供體的單糖部分的相繼轉(zhuǎn)移至受體分子來合成寡糖。因此，“糖基轉(zhuǎn)移酶”催化糖部分從其核苷酸供體轉(zhuǎn)移至多肽、脂質(zhì)、糖蛋白或糖脂的受體部分。該過程也被稱為“糖基化”。作為例如糖蛋白的結(jié)構(gòu)部分的碳水化合物部分也被稱為“聚糖”。聚糖構(gòu)成最流行的所有已知的翻譯后蛋白修飾。聚糖參與和粘附、免疫應(yīng)答、神經(jīng)細(xì)胞遷移和軸突延伸一樣多樣的廣泛系列的生物識別過程。作為糖蛋白的結(jié)構(gòu)部分，聚糖也在蛋白折疊和蛋白穩(wěn)定性和生物活性的支持中具有作用。

在糖基轉(zhuǎn)移酶催化中，單糖單元葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、葡糖醛酸(GlcUA)、半乳糖醛酸(GalUA)和木糖被活化為尿苷二磷酸(UDP)-α-D衍生物；阿拉伯糖被活化為UDP-β-L衍生物；甘露糖(Man)和巖藻糖分別被活化為GDP-α-D和GDP-β-L衍生物；且唾液酸(=Neu5Ac；=SA)被活化為β-D-Neu5Ac的CMP衍生物。

許多不同的糖基轉(zhuǎn)移酶有助于聚糖的合成。糖蛋白的碳水化合物部分的結(jié)構(gòu)多樣性特別大，且通過復(fù)雜的生物合成途徑來確定。在真核生物中，糖蛋白的聚糖-部分的生物合成發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(“ER”)和高爾基體的內(nèi)腔中。糖蛋白的單一(支鏈或直鏈)碳水化合物鏈通常是N-或O-連接的聚糖。在翻譯后加工過程中，碳水化合物通常經(jīng)由天冬酰胺(“N-連接的糖基化”)，或經(jīng)由絲氨酸或蘇氨酸(“O-連接的糖基化”)連接至多肽。聚糖的合成（無論N-連接或O-連接(=“N-/O-連接的”)）由幾種不同的膜錨定的糖基轉(zhuǎn)移酶的活性影響。糖蛋白可以包含一個或多個聚糖連接的氨基酸(=“糖基化位點”)。特定聚糖結(jié)構(gòu)可以是直鏈或支鏈的。支鏈?zhǔn)翘妓衔锏娘@著特征，其與DNA、RNA和多肽通常的線性性質(zhì)相反。與它們的基本構(gòu)建塊的大異質(zhì)性組合，單糖，多糖結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出高多樣性。此外，在特別的糖蛋白種類的成員中，連接至特定糖基化位點的聚糖的結(jié)構(gòu)可以變化，因此導(dǎo)致各自糖蛋白種類(即，共享多肽部分的相同氨基酸序列的種類)的微異質(zhì)性（microheterogeneity）。

唾液酸轉(zhuǎn)移酶(=“ST”)是催化唾液酸(=5-N-乙酰神經(jīng)氨酸=Neu5Ac=NANA)殘基從供體化合物轉(zhuǎn)移至(ⅰ)糖脂或神經(jīng)節(jié)苷脂的末端單糖受體基團或(ii)糖蛋白的N-/O-連接的聚糖的末端單糖受體基團的糖基轉(zhuǎn)移酶。對于哺乳動物唾液酸轉(zhuǎn)移酶（其包括人ST種類），存在作為胞苷-5'-單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸(=CMP-Neu5Ac=CMP-NANA)的共同供體化合物。唾液酸殘基的轉(zhuǎn)移也被稱為“唾液酸化(sialylating)”和“唾液酸化(sialylation)”。

在唾液酸化的糖蛋白的聚糖結(jié)構(gòu)中，通常在寡糖的末端位置中發(fā)現(xiàn)(一個或多個)唾液酸部分。由于所述末端（即暴露位置），唾液酸可以參與許多不同的生物識別現(xiàn)象且服務(wù)于不同種類的生物相互作用。在糖蛋白中，可以存在多于一個唾液酸化位點，即能夠充當(dāng)唾液酸轉(zhuǎn)移酶的底物且作為適合于唾液酸殘基的轉(zhuǎn)移的受體基團的位點。此類多于一個位點原則上可以是錨定在糖蛋白的不同的糖基化位點的多個線性聚糖部分的末端。此外，支鏈聚糖可以具有其中可以發(fā)生唾液酸化的多個位點。