[發明專利]用于使用N-末端截短的β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸轉移酶變體的糖蛋白的單-和二唾液酸化的方法

在審

• 申請號: 201480038103.5
• 申請日: 2014-07-03
• 公開（公告）號: CN105358703A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發明（設計）人: T.察巴尼;A.恩格爾;M.格里夫;C.容;C.盧利;S.馬利克;R.米勒;B.尼德茨基;D.里比奇;K.施默爾策;H.施瓦布;H.佐貝克;B.蘇普曼;M.托曼;S.齊岑巴赫爾
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C12P19/18
• 分類號: C12P19/18;C12P21/00;C12N9/10;C07K16/00
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 梁謀;黃希貴

1.一種組合物，其包含允許糖基轉移酶活性的水性緩沖液，所述組合物進一步包含：

(a)糖基化的目標分子，所述目標分子選自糖蛋白和糖脂，所述目標分子包含多個觸角，所述觸角中的至少兩個各自具有作為末端結構的在半乳糖基殘基中的C6位置具有羥基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分；

(b)SEQIDNO:2的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸轉移酶I(Δ89hST6Gal-I)；

(c)SEQIDNO:3的N-末端截短的人β-半乳糖苷-α-2,6-唾液酸轉移酶I(Δ108hST6Gal-I)；

(d)作為唾液酸轉移酶催化的反應的供體化合物的胞苷-5’-單磷酸-N-乙酰神經氨酸。

2.根據權利要求1的組合物，其中所述目標分子是選自糖基化的細胞表面蛋白、糖基化的蛋白信號傳導分子、糖基化的免疫球蛋白和糖基化的病毒來源的蛋白的糖蛋白。

3.根據權利要求1和2中任一項的組合物，其中Δ89hST6Gal-I和Δ108hST6Gal-I各自以預定量存在。

4.根據權利要求3的組合物，其中Δ89hST6Gal-I和Δ108hST6Gal-I的各自量具有預定的酶促活性。

5.根據權利要求1至4中任一項的組合物的用途，其用于在體外和允許糖基轉移酶酶促活性的條件下產生具有添加至目標分子的一個或多個觸角末端結構的一個或多個唾液酸殘基的唾液酸化目標分子。

6.根據權利要求5的用途，其為根據權利要求3或權利要求4的組合物用于體外產生具有受控量的添加至目標分子的一個或多個觸角末端結構的唾液酸殘基的唾液酸化目標分子的用途。

7.根據權利要求5和6中任一項的用途，其中Δ89hST6Gal-I催化二-唾液酸化的目標分子或更高唾液酸化的目標分子的形成，且Δ108hST6Gal-I催化單唾液酸化的目標分子的形成。

8.用于體外產生具有受控量的添加至目標分子的一個或多個觸角末端結構的唾液酸殘基的唾液酸化目標分子的方法，所述目標分子選自糖蛋白和糖脂，所述目標分子包含多個觸角，所述觸角中的至少兩個各自具有作為末端結構的在半乳糖基殘基中的C6位置具有羥基的β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺部分，所述方法包括以下步驟：

(a)提供根據權利要求3或權利要求4的組合物；

(b)在允許糖基轉移酶酶促活性的條件下且持續預定時間間隔溫育步驟(a)的組合物，從而形成末端觸角N-乙酰神經氨酰基-α2,6-β-D-半乳糖基-1,4-N-乙酰基-β-D-葡糖胺殘基，其中?89hST6Gal-I催化雙唾液酸化目標分子的形成，且?108hST6Gal-I催化單唾液酸化目標分子的形成，

從而體外產生具有受控量的添加至目標分子的一個或多個觸角末端結構的唾液酸殘基的唾液酸化目標分子。

9.根據權利要求8的組合物，其中所述目標分子與Δ89hST6Gal-I和Δ108hST6Gal-I在相同容器中和相同條件下同時溫育。

10.根據權利要求9的方法，其中Δ89hST6Gal-I催化二-唾液酸化的目標分子或更高唾液酸化的目標分子的形成，且Δ108hST6Gal-I催化單唾液酸化的目標分子的形成。

11.根據權利要求10的方法，其中Δ108hST6Gal-I酶促活性的量相對于Δ89hST6Gal-I酶促活性的量更高導致形成單唾液酸化的目標分子的可能性與形成二-或更高唾液酸化的目標分子的可能性相比增加。

12.根據權利要求8至11中任一項的方法，其中所述目標分子不含作為觸角末端結構的唾液酸殘基。

13.根據權利要求12的方法，其中所述目標分子是IgG類的單克隆抗體，具體地選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。

14.糖基化的目標分子的制備物，所述目標分子為IgG亞類的免疫球蛋白分子，其中所述制備物中的單和雙唾液酸化的目標分子的量是受控量，所述制備物通過根據權利要求8至13中任意的方法獲得。