[發(fā)明專利]基于鏈侵入的DNA擴(kuò)增方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201480036626.6
• 申請(qǐng)日: 2014-04-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105358711A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-02-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: S·費(fèi)倫恩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 歐雷恩診斷公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京北翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11285
• 代理人: 孫占華;姜建成

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及通過(guò)基于鏈侵入的DNA擴(kuò)增檢測(cè)產(chǎn)毒艱難梭菌(Clostridiumdifficile,C.difficile)的方法。本發(fā)明還涉及適用于該方法的寡核苷酸、組合物和試劑盒，以及它們用于檢測(cè)產(chǎn)毒艱難梭菌的用途。

背景技術(shù)

梭菌屬是革蘭氏陽(yáng)性、形成孢子的厭氧菌。致病的梭菌屬菌種產(chǎn)生蛋白毒素，其中大的梭菌細(xì)胞毒素(LCT)的組由具有高體內(nèi)毒性以及高結(jié)構(gòu)和序列同源性的非常大的毒素組成(vonEichel-Streiberetal,1996)。艱難梭菌毒素A和毒素B是艱難梭菌致病性的主要原因。長(zhǎng)期以來(lái)，毒素A被認(rèn)為是主要的毒力因子，但是越來(lái)越多的證據(jù)表明，事實(shí)上毒素B在艱難梭菌感染中發(fā)揮主要作用(Lyrasetal,2009；Carteretal.,2012)。

艱難梭菌毒素A和B分別由基因tcdA和tcdB編碼，所述基因位于～19.6kb的致病性基因座(PaLoc)中。所述PaLoc還包含兩個(gè)調(diào)控基因，即tcdC和tcdR，它們分別充當(dāng)毒素表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子和正調(diào)控因子。也包括在PaLoc中的tcdE編碼毒素A和B分泌必需的穿孔素(holin)樣蛋白。在非產(chǎn)毒的菌株中，所述PaLoc被115bp的序列替換(Braunetal,1996)。DNA擴(kuò)增已被用于檢測(cè)產(chǎn)毒艱難梭菌菌株(Wrenetal,1990；McMillinetal,1991；McMillinetal,1992)。

一種依賴于上游引物、下游引物和鏈侵入系統(tǒng)的等溫DNA擴(kuò)增方法記載于WO2009/150467中。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及檢測(cè)產(chǎn)毒艱難梭菌的靶核酸序列，以使得能夠確定樣品中產(chǎn)毒艱難梭菌的存在。本發(fā)明的方法使用上游引物、下游引物和鏈侵入寡核苷酸，每一種均包含與所述靶核酸序列互補(bǔ)的區(qū)域。組合起來(lái)，所述引物和鏈侵入寡核苷酸確保實(shí)現(xiàn)對(duì)所述靶核酸序列的擴(kuò)增。所述鏈侵入寡核苷酸使至少一部分所述靶核酸序列成為單鏈，以允許結(jié)合所述上游引物和下游引物，從而允許DNA擴(kuò)增。通常，在等溫條件下進(jìn)行所述擴(kuò)增，而不需要進(jìn)行雙鏈DNA的熱變性。

如果檢測(cè)到所述靶核酸序列的擴(kuò)增，這指示所述樣品中存在靶病原體艱難梭菌的產(chǎn)毒菌株，不存在艱難梭菌的非產(chǎn)毒、非致病菌株或其他梭菌屬(Clostridium)菌種。本發(fā)明人已證明，本發(fā)明的方法使得能夠高度特異性和靈敏性地檢測(cè)產(chǎn)毒艱難梭菌的不同靶核酸序列。

本發(fā)明提供了用于檢測(cè)樣品中的產(chǎn)毒艱難梭菌的靶核酸序列的方法，所述方法包括在促進(jìn)所述靶核酸序列擴(kuò)增的條件下使所述樣品與至少一種上游引物、至少一種下游引物和至少一種鏈侵入寡核苷酸接觸，其中每種所述引物和所述寡核苷酸包含與所述靶核酸序列互補(bǔ)的區(qū)域；并且其中所述鏈侵入寡核苷酸使得至少一部分所述靶核酸序列成為單鏈，以允許結(jié)合所述上游引物和下游引物。

本發(fā)明還提供了組合物和試劑盒，每一種均包括至少兩種選自(a)上游引物、(b)下游引物和(c)鏈侵入寡核苷酸的寡核苷酸，其中：

-(I)所述上游引物是長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:2或其變體的序列；所述下游引物是長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:3或其變體的序列；所述鏈侵入寡核苷酸是長(zhǎng)度大于30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:4或其變體的序列，并且在其3’區(qū)域還包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸；或

-(II)所述上游引物是長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:7或其變體的序列；所述下游引物是長(zhǎng)度小于30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:8或其變體的序列；所述鏈侵入寡核苷酸是長(zhǎng)度大于30個(gè)核苷酸的寡核苷酸，其包含SEQIDNO:9或其變體的序列，并且在其3’區(qū)域還包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸。

本發(fā)明還提供了每一種均如以上(I)中所定義的或每一種均如以上(II)中所定義的上游引物、下游引物和鏈侵入寡核苷酸在用于檢測(cè)艱難梭菌的方法中的用途。

本發(fā)明額外地提供了用于診斷受試者中的艱難梭菌感染的方法，其包括在來(lái)自所述受試者的樣品中實(shí)施本發(fā)明的檢測(cè)產(chǎn)毒艱難梭菌的靶核酸序列的方法。

附圖說(shuō)明