[發明專利]活細胞的冷凍保存

在審

• 申請號: 201480029514.8
• 申請日: 2014-06-11
• 公開（公告）號: CN105263320A
• 公開（公告）日: 2016-01-20
• 發明（設計）人: 克里斯托夫·默尼爾;皮埃爾·范卡策姆;巴奧-利安·蘇
• 申請（專利權）人: 那慕爾大學
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 沈敬亭;李海霞

技術領域

本發明涉及冷凍保存(低溫保存(冷凍保存，cryopreservation))細胞，特別是包括藻類的植物細胞、(植物)細胞器以及(植物)組織的領域。

背景技術

植物細胞和組織培養是在基礎和應用研究中廣泛使用的重要工具。它們允許高通量研究，如基因功能和調節、代謝分析或生物農藥(生物殺蟲劑)開發。它們還是引人注目且功能強大的在生物反應器中產生精細化學品的生物機制。尤其是，植物細胞培養在產生適當糖基化和折疊的藥物活性蛋白(如免疫球蛋白、白細胞介素)方面令人感興趣。它們本質上安全，這與哺乳動物或微生物生產平臺相反，因為它們不是宿主人病原體，也不產生內毒素。然而，在涉及植物生物學的各實驗室中維持多種野生型和轉基因細胞系不僅費力費錢，而且還會產生微生物污染、不期望的遺傳改變(例如，染色體變化，包括倍性變化、表觀遺傳不穩定性(epigeneticinstability))以及最終培養物損失的風險。

實際上，大多數的動物和陸生植物使用不同的機制以增強它們在極端環境條件下的存活。例如，為了適應其生長和發育，植物可以感覺小溫度變化(1℃)。此外，生長在溫帶(temperate)和冷氣候區中的大多數植物在其生命周期期間傾向于嚴寒(冰凍，freezing)溫度。在這些環境條件下，導致細胞死亡的主要原因與細胞脫水和由胞外冰形成引發的機械應力連同包圍細胞器或細胞本身的生物膜嚴重損傷有關。因此，植物已經發展出復雜的策略來預防在溫和冷凍條件下的細胞損傷。為了存活，植物通常需要預暴露于非致命溫度，即，冷適應步驟。該過程涉及多種機制，包括累積冷凍保護代謝物和抗凍蛋白。由于極端溫度代表著對于植物的重大壓力，耐凍性仍然為限制全球植物分布的關鍵因素。

50多年來，在材料內整合活細胞已被識別為生物技術中強有力的工具。通過粘附在基質(substrate)上的固定、在材料中的捕獲或包封是可以在新設備如生物反應器、生物傳感器、生物燃料細胞和人工器官的結構中操控全細胞利益的方法。實際上，從其天然環境分離的細胞通常是脆弱的。基于細胞的生物技術裝置因此需要將細胞整合入非生物材料(abioticmaterials)。

保存植物材料的常用策略涉及建立在生長條件下的植物組織或在田間的植物群體的體外收集。對于長期儲存，因為保存植物組織的成本和質量問題，這些方法是不合適的。現在，大多數植物在沒有高濃度冷凍保護劑(防凍劑)(其可以是細胞毒性的)或脫水工序下不能存活于凍融循環。而且，這些方法的成功與復雜的冷卻程序是緊密關聯的。例如，以最佳速率將細胞冷卻到中間溫度(略低于凝固點)，然后在液氮中玻璃化。事實上，這些措施允許在細胞內空間使細胞脫水和冰結晶最小化，其負責不可逆的細胞損傷。最后，由此獲得的生物材料存儲在昂貴的填充液氮的罐中，以使溫度維持在-196℃。在這些條件下，幾乎所有的代謝活動都停止，而活組織可以保存延長的時間。

目前，已經提出了三種不同的方法用于低溫保存在液氮中的植物細胞培養物：

(A)慢冷卻技術

(B)玻璃化(vitrification)方法，以及

(C)在藻酸鹽珠粒內脫水固定化的細胞

描述了各種固定或包封基質。比生物分子遠遠更加靈敏的，活性細胞的固定涉及使用生物相容性材料、溫和(良性，benign)合成條件和外部流體支持系統或浸沒于緩沖液中，以避免脫水。最常使用的材料為多糖及衍生物、聚合物膜、活性碳以及光聚合樹脂。然而，在穩定性與生物相容性方面，這些有機基質顯示出若干局限性。

盡管已普遍冷凍保存哺乳動物和微生物培養物，但用于植物細胞的保存方法的受限報告通常的特征在于低的細胞存活力。

實際上，與其它細胞類型相比，由大型有液泡結構組成的植物細胞懸液更趨于嚴重的低溫損傷。植物細胞死亡的主要原因與細胞脫水和與包圍細胞器或細胞本身的生物膜的嚴重損傷相結合的胞外冰形成引發的機械應力有關。另外，當前方法通常需要昂貴的液氮、專用裝置來提供可編程的冷卻速率以及可能是細胞毒性的高摩爾濃度的冷凍保護劑。由于這些原因，創建冷凍主細胞庫(mastercellbanks)需要可替換的程序。

發明目的

本發明的目的在于提供用于冷凍保存或低溫保存(植物)細胞、(植物)細胞器和(植物)組織(包括例如，植物愈傷組織、分生組織、芽尖(apices)、芽外植體、胚珠和根)的方法和試劑盒，其不存在現有技術的缺點。