[發(fā)明專利]靶序列的富集

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480029041.1
• 申請日: 2014-03-19
• 公開（公告）號: CN105392897B
• 公開（公告）日: 2020-03-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: C·L·理查德
• 申請（專利權(quán)）人: 定向基因組學公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 趙蓉民

提供用于從核酸群體中富集靶序列的方法和組合物，其包括在溶液中使核酸群體和靶分離探針組合，其中所述靶分離探針包括親和結(jié)合結(jié)構(gòu)域；允許靶分離探針的單鏈區(qū)與核酸群體中的靶序列的全部或部分雜交；通過將靶分離探針與捕獲結(jié)構(gòu)域結(jié)合并去除非結(jié)合物質(zhì)而從含靶序列的群體中選擇性地固定雜交核酸；以及通過一個或多個3’單鏈特異性外切核酸酶從靶序列的3’端去除非靶序列。靶富集可用于檢測核甘酸序列中的變異，用于檢測與健康或疾病有關(guān)的表型變化。

背景

已經(jīng)證明下一代測序(Next Generation Squencing)(NGS)是多種疾病的診斷和治療中的寶貴工具，所述疾病包括癌癥(Dancey等人，Cell,48:409-420(2012)；Dawson等人，NEJM,368:1199-1209(2013))、心肌病(Meder等人，Circ.Cardiovasc.Genet.,4:110-122(2011)；Norton等人，Curr.Opin.Cariol.,27:214-20(2012))、遺傳性疾病(Boycott等人，Nature Genetics,14:681-691(2013)),產(chǎn)前篩查(Nepomnyashchaya等人，Clin ChemLab Med.,51:1141-54(2013)；Papgeorgiou等人，Genome Medicine,4:46(2012))以及神經(jīng)紊亂(Nemeth等人，Brain,136:3106-180(2013))。然而，盡管NGS能夠在數(shù)天內(nèi)對整個人類基因組進行測序，但是測序的成本以及數(shù)據(jù)分析的負擔嚴重抑制了將全基因組測序轉(zhuǎn)移到臨床。結(jié)果，期望靶序列的富集促進依賴于NGS(Agilent,(Santa Clara,CA),Roche/NimbleGen(Madison,WI),Illumina(San Diego,CA),LifeTechnologies(Grand Island,NY))、多重PCR(LifeTechnologies,Illumina,Qiagen(Valencia,CA),Kailos Genetics(Huntsville,AL))、分子倒置探針(Hiatt等人，Genome Res.,23,843-54(2013))、高度并行PCR(highly-parallel PCR)(Fluidigm(San Francisco,CA),Raindance(Billerica,MA))和單引物擴增法(Enzymatics/ArcherDx(Beverly,MA),NuGen(San Carlos,CA))的分子診斷。

用于富集的現(xiàn)有方法包括來自制備DNA文庫的雜交捕獲(Albert等人，NatureMethods,4:903-905(2007)；Okou等人，Nature Methods,4:907-909(2007))。雜交捕獲需要大量的固定化探針。理論上，溶液中的片段化核酸與這些固定化探針雜交——如果它們具有互補序列的話。除可以捕獲雙鏈體的兩條鏈之外，這些方法具有與溶液雜交相同的缺點。然而，這些方法的其它缺點包括當探針在雜交之前結(jié)合至表面時雜交效率降低。其它缺點包括漫長的2-3天方案、多個步驟增加測試成本、需要大量的初始輸入DNA(1μg-5μg)；寬的文庫大小分布、僅55％-65％的特異性、80％+/-200-500個堿基對(bp)以及不能捕獲重復或不能處理含非靶序列內(nèi)的重復序列的核酸。

由于對靶末端處人工序列的依賴，現(xiàn)有方法不適于指定讀取起始位點(核酸分子測序開始的位置)。而且，現(xiàn)有方法不適于捕獲兩條靶鏈。由于無能力具體限定讀取起始位點，當前雜交方法通常捕獲大于外顯子平均大小——如Sakharkar等人，In SilicoBiology,4：387-393(2004)所述的小于200bp——的核酸片段，從而實質(zhì)上導致非靶測序?；陔s交的外顯子組捕獲技術(shù)的性能比較已經(jīng)由Clark等人，Nature Biotechnology,29:908–914(2011)評論。