[發明專利]靶序列的富集

有效

• 申請號: 201480029041.1
• 申請日: 2014-03-19
• 公開（公告）號: CN105392897B
• 公開（公告）日: 2020-03-20
• 發明（設計）人: C·L·理查德
• 申請（專利權）人: 定向基因組學公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 趙蓉民

1.用于從核酸群體富集用于銜接子連接的靶序列的方法，其包括：

(a)在溶液中組合核酸群體和靶分離探針，其中所述靶分離探針包括親和結合結構域；

(b)允許所述靶分離探針的單鏈區與所述核酸群體中的靶序列的全部或部分雜交；

(c)通過將所述靶分離探針與捕獲結構域結合并去除非結合物質從包含所述靶序列的所述群體中選擇性地固定(b)的雜交的核酸而富集所述靶序列；

(d)通過一種或多種3’單鏈特異性外切核酸酶從(c)的所述固定的靶序列的3’端去除非靶序列以允許在所述靶序列的指定讀取起始位點形成平端；和

(e)將銜接子的5’端連接到所述靶序列的3’端。

2.根據權利要求1所述的方法，其中在所述群體中所述核酸中的一些或全部包含重復序列，并且其中(a)進一步包括將與所述重復序列雜交的可去除阻斷寡核苷酸與所述核酸群體組合。

3.根據權利要求2所述的方法，其中(d)進一步包括選擇性地降解所述可去除阻斷寡核苷酸。

4.根據權利要求1所述的方法，其中在(b)中所述靶分離探針的所述單鏈區與所述靶序列的第一部分雜交。

5.根據權利要求4所述的方法，其中所述靶分離探針的末端與在所述靶序列的3’端或5’端處或接近所述靶序列的3’端或5’端的序列形成雙鏈體。

6.根據權利要求4所述的方法，在(b)之后進一步包括：允許第二探針的單鏈區與所述靶序列的第二部分雜交。

7.根據權利要求6所述的方法，其中所述第二探針與臨近、接近或遠離所述靶分離探針的所述靶序列的部分雜交。

8.根據權利要求7所述的方法，其中所述第二探針的末端與在所述靶序列的5’端或3’端或接近所述靶序列的5’端或3’端但不是兩者處的序列形成雙鏈體。

9.根據權利要求8所述的方法，其中所述靶分離探針在所述靶序列的一端雜交，并且所述第二探針與所述靶序列的相對端雜交，使得所述靶分離探針和所述第二探針的雜交限定所述靶序列的末端。

10.根據權利要求4所述的方法，其中所述親和結合結構域位于所述靶分離探針的3’端。

11.根據權利要求4所述的方法，其中所述親和結合結構域位于所述靶分離探針的3’端和5’端之間。

12.根據權利要求6所述的方法，其中所述靶分離探針或位于所述靶序列5’部分的所述第二探針是活瓣探針，所述活瓣探針具有雜交單鏈區和從所述單鏈區3’端延伸的非雜交雙鏈區。

13.根據權利要求1所述的方法，進一步包括(f)通過一種或多種5’單鏈特異性外切核酸酶從所述靶序列的5’端去除非靶序列。

14.根據權利要求12所述的方法，其中所述非雜交雙鏈區包括3’-5’寡核苷酸或與自身雜交的探針中的一部分，以形成發夾序列，并且其中所述方法進一步包括在所述靶分離探針或所述第二探針與所述靶序列雜交之后將所述3’-5’寡核苷酸或發夾序列連接到所述靶分子的5’端。

15.根據權利要求13所述的方法，其進一步包括步驟(g)：將銜接子的3’端連接到所述靶序列的5’端。

16.根據權利要求13所述的方法，其進一步包括通過聚合酶延伸所述靶分離序列的3’端，以在5’單鏈特異性外切核酸酶消化后取代所述5’探針。

17.根據權利要求15所述的方法，其中所述方法進一步包括(h)：測定所述靶序列。