[發明專利]因子VIII和血管性血友病因子的共表達

有效

• 申請號: 201480028870.8
• 申請日: 2014-03-18
• 公開（公告）號: CN105229143B
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發明（設計）人: 約翰·亨德森·麥克維伊;伊恩·加納;阿黛爾·戴爾;布魯斯·弗農
• 申請（專利權）人: 普羅法克特制藥有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 柳春琦

本發明涉及細胞中重組因子VIII(rFVIII)的功能性表達并且尤其涉及其在體外和/或體內應用中自細胞的穩定表達和分泌。

發明領域

本發明涉及重組因子VIII(rFVIII)在細胞中的功能性表達并且尤其涉及其在體外和/或體內應用中自細胞的穩定表達和分泌。

發明背景

因子VIII(FVIII)是大的復雜糖蛋白。其合成為330kDa的蛋白，具有結構域結構A1-A2-B-A3-C1-C2，其中A和C兩個結構域具有內部序列同源性并且與因子V的A和C結構域具有約40％序列同一性。構成總序列的38％的B-結構域，與其他已知蛋白(包括因子V的B-結構域)沒有序列同一性。然而，其被廣泛糖基化并且含有整個分子上的26個天冬酰胺(N)-連接的糖基化位點中的19個。

對FVIII的生物合成的深入了解已經來自于為了生產rFVIII以用于治療目的對異源細胞類型中的表達的分析。此外，對造成與因子V和VIII的聯合缺陷相關的常染色體隱性出血障礙的分子缺陷的表征揭示了FVIII的生物合成中細胞內運輸的重要性(1、2)。

rFVIII的早期研究表明，可以使B結構域缺失而不損失FVIII的促凝血活性(在3中綜述)。編碼缺失B結構域的rFVIII的表達盒導致顯著高于相當的全長rFVIII表達盒的mRNA水平，從而導致更高的rFVIII蛋白合成水平。然而，分泌到培養基中的rFVIII的水平并不相稱地增加，提示細胞內相互作用限制有效分泌(4)。rFVIII共翻譯地轉移至ER腔中，在那里，其折疊并組裝為三級結構。這些反應通過與rFVIII的折疊中間體相互作用的酶和分子伴侶來促進。

在體內，在其分泌到循環中之后，FVIII立即相互作用，形成緊密的非共價復合體，所述復合體保護其免于被蛋白水解過早清除或失活。FVIII通過A3和C2結構域中的兩個位點結合血管性血友病因子(von willebrand factor，VWF)。在體外，已經顯示，將VWF添加到培養基中或通過用VWF表達盒轉染表達rFVIII的細胞共表達，導致通過增加rFVIII在培養基中的穩定性增加rFVIII的積累(6)。已經提出，VWF促進rFVIII從細胞表面解離并且還可以促進rFVIII的重鏈和輕鏈的雙鏈異二聚體的組裝(14、15)，然而認為其在到細胞外部后僅與FVIII形成非共價復合體。

整個B-結構域的缺失，導致mRNA和初級翻譯產物17倍的增加，但僅導致分泌蛋白水平的30％增加，提示ER-高爾基體轉運速率降低并且FVIII mRNA的水平不限制表達(4)。引入已知在FVIII的ER-高爾基體轉運中重要的多個N-連接的糖基化位點增加分泌的FVIII的水平，提示，ER-高爾基體轉運的速率可能是限速步驟(7)。然而，由于未能正確折疊，ER內大量的FVIII不轉運至高爾基體，并且錯誤折疊的FVIII在ER中的積累可以導致氧化損傷和凋亡(5)，提示FVIII折疊是FVIII表達中的限速步驟。

在近期的被設計成用于研究具有各種B-結構域構建體的FVIII表達盒的效果的研究中，還研究了針對在人中的表達對這些序列進行密碼子優化的效果(8)。將人胚腎細胞(HEK293T)細胞瞬時轉導并且在72h后評價FVIII的表達。令人驚訝的是，未觀察到B結構域區域的并入的顯著影響，然而觀察到自密碼子優化的序列的功能性FVIII表達的7至30倍的增加。盡管蛋白二級結構主要由氨基酸序列決定，細胞內的蛋白折疊受多種因素影響：這些包括與其他蛋白(分子伴侶)和配體的相互作用，經ER膜的轉移和氧化還原條件。翻譯速率也可以影響蛋白折疊并且已經提示，密碼子使用可以是調節翻譯速度的機制并且因此允許個體蛋白結構域的逐步折疊(9、10)。FVIII是復雜的多結構域蛋白，其中新生多肽鏈的非連續段在三維折疊中可能相互作用。核糖體在‘稀有’密碼子處停滯可以因此導致替代的折疊途徑，產生改變的構象和可能錯誤折疊的蛋白。對于觀察到的密碼子優化的序列的效果的可能解釋可以是，它們允許有效翻譯和跨ER膜運輸，讓新生FVIII多肽鏈正確折疊，導致在體外和體內觀察到增加的分泌的FVIII水平。