[發明專利]因子VIII和血管性血友病因子的共表達

有效

• 申請號: 201480028870.8
• 申請日: 2014-03-18
• 公開（公告）號: CN105229143B
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發明（設計）人: 約翰·亨德森·麥克維伊;伊恩·加納;阿黛爾·戴爾;布魯斯·弗農
• 申請（專利權）人: 普羅法克特制藥有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 柳春琦

1.穩定的體外哺乳動物細胞，其中所述細胞是HEK293、CHO、3T3、BHK、MICK、Vero、Junket或HeLa細胞，以及本領域中已知的這些細胞的衍生物，所述哺乳動物細胞包含外源引入的能夠重組表達FVIII的核酸，其中編碼所述FVIII的核酸或其部分已被密碼子優化以用于由所述哺乳動物細胞表達；并且其中所述細胞還已被轉染以能夠重組表達血管性血友病因子(VWF)的載體。

2.根據權利要求1所述的哺乳動物細胞，其中編碼VWF的核酸也已被密碼子優化以用于由所述哺乳動物細胞表達。

3.根據權利要求1或2所述的哺乳動物細胞，其中哺乳動物FVIII是人FVIII或人FVIII的缺失B結構域的版本。

4.根據權利要求1所述的哺乳動物細胞，其中哺乳動物FVIII是針對倉鼠進行密碼子優化的人FVIII或人FVIII的缺失B結構域的版本并且所述哺乳動物細胞是CHO或BHK細胞。

5.根據權利要求1所述的哺乳動物細胞，其中FVIII氨基酸序列是B結構域已經缺失，并且任選地被富含天冬酰胺連接的寡糖的短B-結構域間隔區替代的FVIII序列。

6.根據權利要求1所述的哺乳動物細胞，其中FVIII氨基酸序列是SEQ ID NO：3中所示的序列。

7.根據權利要求1所述的哺乳動物細胞，其中編碼哺乳動物FVIII的核酸序列與SEQ IDNO：1中所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％相同，或相同。

8.根據權利要求1所述的哺乳動物細胞，其中VWF氨基酸序列是SEQ ID NO：4中所示的序列。

9.根據權利要求1所述的哺乳動物細胞，其中VWF核酸序列是SEQ ID NO：2中所示的序列。

10.細胞培養物，所述細胞培養物包含根據任一在前權利要求所述的哺乳動物細胞，所述哺乳動物細胞能夠以≥0.1pg/細胞/天的量表達FVIII。

11.細胞培養物，所述細胞培養物包含根據權利要求1-9中任一項所述的哺乳動物細胞，其能夠以≥0.25p g/細胞/天的量表達FVIII。

12.體外制備重組哺乳動物FVIII或FVIII的缺失B結構域的版本的方法，所述方法包括提供細胞，用能夠重組表達VWF的載體轉染所述細胞并且之后進一步用能夠重組表達FVIII或FVIII的缺失B結構域的版本的載體轉染用VWF轉染的細胞，其中所述轉染利用載體進行，所述載體包含能夠在所述細胞中表達FVIII或FVIII的缺失B結構域的版本和VWF的密碼子優化的核酸構建體。

13.根據權利要求12所述的方法，所述方法包括以至多0.5μM的濃度向所述細胞培養基添加甲氨蝶呤。

14.根據權利要求12-13中任一項所述的方法，所述方法還包括從所述細胞和/或所述細胞生長的培養基純化FVIII或FVIII的缺失B結構域的版本或包含FVIII或FVIII的缺失B結構域的版本的復合體。

15.根據權利要求12所述的方法，其中編碼哺乳動物FVIII的核酸序列與SEQ ID NO：1中所示的序列至少90％、95％、96％、97％、98％、99％相同，或相同。