[發明專利]用于個人表觀基因組學的至天然染色質的轉座

有效

• 申請號: 201480028601.1
• 申請日: 2014-05-20
• 公開（公告）號: CN105339503B
• 公開（公告）日: 2020-04-10
• 發明（設計）人: P·吉里西;J·D·比恩羅斯特羅;張元豪;W·J·格林里夫
• 申請（專利權）人: 斯坦福大學托管董事會
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/6869;G16B30/00;G16B20/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 李程達

政府支持

本發明是在國立衛生研究院授予的合同AI057229、HG000044和NS073015下由政府支持作出的。政府具有本發明的某些權利。

交叉引用

本申請要求2013年5月23日提交的美國臨時申請系列號61/826728的利益，該申請通過引用以其整體并入本文。

背景

真核生物基因組分層次地包裝成染色質，并且此包裝的性質在基因調控中起著中心作用。對編碼在染色質的核蛋白結構中的表觀遺傳信息的主要認知來自于高通量的全基因組方法，其用于單獨測定染色質可接近性(“開放染色質”)、核小體定位和轉錄因子(TF)占據。雖然存在已公開的方案，但這些方法需要數百萬個細胞作為起始材料、復雜和費時的樣品制備并不能同時探測核小體定位、染色質可接近性和TF結合的相互作用。這些限制在三個主要方面存在問題：第一，目前的方法可平均和“淹沒”細胞群的異質性。第二，細胞通常必須離體生長以獲得足夠的生物材料，從而擾亂體內背景并且以未知的方式調節表觀遺傳狀態。第三，輸入要求通常會阻止這些測定應用于明確定義的臨床樣品，從而妨礙診斷時間尺度上“個人表觀基因組學”的產生。本文提供的是可以克服這些限制的方法，其用于分析多核苷酸包括其可接近性及其結構。還提供的是單細胞方法，其可以提供較高的靈敏度和對染色質可接近性的進一步信息，包括細胞間變異性，以潛在地使其用作生物標志物。

概述

本文提供了用于分析多核苷酸例如基因組DNA的方法。在某些實施方案中，該方法包括：(a)用轉座酶和分子標簽處理分離自細胞群的染色質以產生多核苷酸的標記片段；(b)測序標記片段的一部分以產生多個序列讀數；和(c)通過將獲自序列讀數的信息映射至細胞的基因組的區域而制作所述細胞的基因組的該區域的表觀遺傳圖譜。

在一些情況下，信息通過使用在序列讀數的開頭的核苷酸序列和任選末端上的核苷酸序列獲得。在某些情況下，在(c)中映射的信息選自下列的一種或多種：(i)轉座酶的切割位點；(ii)在步驟(a)中產生的片段的大?。?iii)序列讀數長度；(iii)確定長度范圍的序列讀數的位置；和(iv)序列讀數豐度。在一些情況下，確定大小范圍的片段是無核小體的片段。

在一些情況下，表觀遺傳圖譜顯示下列的一種或多種：(i)沿該區域的染色質可接近性的特征譜；(ii)該區域中結合位點的DNA結合蛋白的占據；(iii)該區域中的無核小體的DNA；(iv)沿該區域的核小體定位；和/或(v)染色質狀態。在一些情況下，該方法還可包括測量DNA結合蛋白對于結合位點的總體占據。DNA結合蛋白可以例如是轉錄因子。

在一些情況下，細胞群可以包括約500至100,000個細胞。細胞可以分離自個體，例如分離自該個體的血液。在一些實例中，細胞可以是相同的細胞類型。在一些實例中，細胞可以是FACS選擇的細胞。

在一些情況下，處理步驟(a)可以包括：從細胞群分離細胞核；和將分離的細胞核與插入酶復合物組合，其中所述組合導致細胞核裂解以釋放染色質，以及導致產生基因組DNA的標記片段。在一些實例中，轉座酶可來源于Tn5轉座酶。在其它實例中，轉座酶可來源于MuA轉座酶。在進一步的實例中，轉座酶可來源于Vibhar轉座酶(例如來源于哈氏弧菌(Vibrioharveyi))。

本公開內容還提供了用于比較兩種樣品的方法，其包括：(a)分析第一細胞群以產生第一表觀遺傳圖譜；和(b)分析第二細胞群以產生第二表觀遺傳圖譜；以及(c)比較第一表觀遺傳圖譜與第二表觀遺傳圖譜。例如，第一細胞群和第二細胞群可以是從相同個體在不同的時間收集的。或者，第一細胞群和第二細胞群可以是從不同個體收集的不同細胞群。

本公開內容還提供了一種診斷方法，其包括：分析來自患者的染色質以產生表觀遺傳圖譜；和基于表觀遺傳圖譜提供診斷或預后。

本公開內容提供了用于測定多核苷酸在某位點的可接近性的方法，其中所述多核苷酸來自細胞樣品，所述方法包括：(a)用插入酶將多個分子標簽插入多核苷酸；和(b)使用所述分子標簽來測定所述位點上的可接近性。該方法還可包括使用所測定的可接近性來鑒定在所述位點上結合至多核苷酸的一種或多種蛋白。在一些情況下，所述蛋白的至少一種是轉錄因子。該方法還可包括使用分子標簽來產生多核苷酸的可接近性圖。