[發(fā)明專利]蛋白純化的新穎方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480028322.5
• 申請日: 2014-03-14
• 公開（公告）號: CN105247036B
• 公開（公告）日: 2019-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 斯蒂芬·霍利
• 申請（專利權(quán)）人: 安迅生物制藥公司
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12N1/06
• 代理公司: 北京安信方達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11262
• 代理人: 鄭霞

本公開內(nèi)容提供了用于釋放細胞內(nèi)蛋白的方法。該方法允許從細胞分離感興趣的蛋白，不需機械破碎細胞、不需從培養(yǎng)基分離細胞且不需從培養(yǎng)基取出細胞。

關(guān)于聯(lián)邦政府資助的研究的聲明

本文公開的本發(fā)明部分由政府資助做出，且政府在本發(fā)明中擁有某些權(quán)利。特別地，本文公開的本發(fā)明的部分部分地根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院給予的合同號N01-AI-60015C得到資助。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明總體上涉及從細胞培養(yǎng)物獲取細胞內(nèi)蛋白的新穎方法和試劑。

背景

圍繞大規(guī)模純化蛋白的關(guān)注對于生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)是日益重要的問題。許多紊亂已是蛋白或酶替代療法的主題，所述紊亂包括營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥(dystrophicepidermolysis bullosa)和溶酶體貯積紊亂(lysosomal storage disorders)諸如戈謝病(Gaucher disease)、法布里病(Fabry disease)和龐貝氏病(Pompe disease)。供應(yīng)患者需要的大規(guī)模蛋白生產(chǎn)一定是成本敏感的，具有生產(chǎn)效率和出產(chǎn)高質(zhì)量產(chǎn)品。蛋白純化的過程是時間漫長的、繁重的和昂貴的。這些缺點大大地影響蛋白替代療法的成本并通常對醫(yī)療保健構(gòu)成巨大的挑戰(zhàn)。

蛋白生產(chǎn)主要在細胞內(nèi)完成，即，哺乳動物、細菌或真菌，它們通過插入包含用于該蛋白的基因的重組質(zhì)粒被工程化以產(chǎn)生感興趣的蛋白。在復(fù)合生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達感興趣的蛋白的細胞，該復(fù)合生長培養(yǎng)基包含通常由動物血清制劑提供的糖、氨基酸和生長因子。純化需要從供給細胞的化合物和細胞碎片的混合物分離期望的蛋白以便以高質(zhì)量純化足夠的量用作人類治療劑。

用于從細胞碎片純化蛋白的程序是漫長和復(fù)雜的。取出感興趣的蛋白需要的多個和重復(fù)的步驟大大地降低最終蛋白的產(chǎn)率和質(zhì)量。在許多情況下，蛋白在純化后必須是功能性的。

在生物學(xué)表達系統(tǒng)的細胞內(nèi)區(qū)室中表達的重組蛋白在存在細胞壁的情況下通常通過機械破碎從表達系統(tǒng)細胞釋放。此類機械方法包括勻漿化、微流化、氮爆、超聲和珠攪拌方法。其他方法包括添加酶以部分地降解細胞壁組分隨后用滲透劑以誘導(dǎo)周質(zhì)內(nèi)含物的破裂和釋放。結(jié)合酶消化和化學(xué)處理的這些方法主要用于在革蘭氏陰性細菌中靶向周質(zhì)間隙的表達的蛋白。沒有細胞壁的細胞可通過滲透壓而不不添加酶，或通過使用去垢劑或有機溶劑完全破碎細胞膜來破碎。為了提高效率可組合使用破碎方法。

大多數(shù)以前的方法僅適用于從周質(zhì)區(qū)室釋放蛋白或?qū)е录毎麉^(qū)室完全破碎。當(dāng)完全破碎細胞時，DNA可從亞細胞區(qū)室被釋放并導(dǎo)致高粘性液體的形成。DNA可被剪切或酶促降解以降低粘性并使在大規(guī)模生產(chǎn)期間處理工藝流體流(the process fluid stream)成為可能。這些步驟成功地用于醫(yī)藥級蛋白的生產(chǎn)；然而，每個處理步驟增加了制造的復(fù)雜性，時間和成本。

發(fā)明概述

本公開內(nèi)容提供了新穎方法和試劑，所述新穎方法和試劑涉及從存在于培養(yǎng)基中的細菌細胞特別是大腸桿菌(E.coli)純化感興趣的細胞內(nèi)蛋白的方法，而(i)沒有從培養(yǎng)基取出細胞，(ii)不使用細胞的機械破碎或不使用酶降解細胞壁；和(iii)沒有將細胞群壓實成濃縮的沉淀形式。

所公開的方法用于通過添加透化細胞用于釋放重組蛋白的預(yù)定組合無機鹽和去垢劑來釋放細胞內(nèi)的重組蛋白，而不導(dǎo)致細胞的全部破碎，從而減少DNA釋放的量和產(chǎn)生的增加的粘度。

可通過在選擇性沉淀后的離心步驟從可溶的重組蛋白純化出剩余的細胞碎片。

該方法可通過一系列步驟完成，所述步驟包括在完成細胞培養(yǎng)(即，發(fā)酵)后將適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑添加到生物反應(yīng)器。以逐步的方式將這些化學(xué)試劑添加到培養(yǎng)物。還添加試劑以便實現(xiàn)該試劑的特定濃度。該方法需要化學(xué)試劑在溶液中的存在規(guī)定的時間量。

該方法不需要從細胞培養(yǎng)物分離細胞。另外，它不需要在添加試劑(“釋放試劑”)前除去生長培養(yǎng)基。該方法不利用機械破碎裂解細胞。