[發(fā)明專利]使用重組酵母全細(xì)胞的豬圓環(huán)病毒(PCV2)亞單位疫苗及其制造方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480026972.6
• 申請日: 2014-03-11
• 公開（公告）號: CN105247037A
• 公開（公告）日: 2016-01-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 崔毅星;樸景民;徐成和;安廷梧;李殷教;金千錫;尹寅重;俞成植;沈?qū)庁?/a>
• 申請（專利權(quán)）人: 韓國生命工學(xué)研究院;中央疫苗研究所
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/34;A61K39/12
• 代理公司: 北京派特恩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11270
• 代理人: 景鵬;姚開麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于為母豬和豬崽接種疫苗的重組的豬圓環(huán)病毒(PCV2)亞單位疫苗及其生產(chǎn)方法，該重組的豬圓環(huán)病毒(PCV2)亞單位疫苗包括重組的酵母全細(xì)胞并且可預(yù)防豬圓環(huán)病毒(PCV)相關(guān)的疾病。

背景技術(shù)

豬圓環(huán)病毒2(PCV-2)已知是斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要致病源的病毒。難以開發(fā)能夠預(yù)防豬圓環(huán)病毒造成傷害的疫苗的原因是，使用動物細(xì)胞生產(chǎn)疫苗需要相對昂貴的培養(yǎng)基和動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，以及在血清培養(yǎng)基中所含的各種異源蛋白有可能在接種期間產(chǎn)生副作用。

四種基于來自PCV2a病毒的ORF2抗原的PCV2疫苗正在全球市場上出售。在外國，在技術(shù)上處于最高水平的公司是梅里亞(Merial，法國)，該公司有很多與PCV相關(guān)的專利，并且使用經(jīng)滅活的PCV2全病毒(Circovac)。勃林格殷格翰(BoehringerIngelheim)開發(fā)了一種通過在桿狀病毒中表達(dá)ORF2所獲得的基于重組蛋白的疫苗(避開了PCV和Ciroflex)，其中該疫苗的優(yōu)點在于純化之后每次以1ml的量進(jìn)行注射。英特威(Intervet)有限公司通過在桿狀病毒中表達(dá)ORF2并且純化表達(dá)產(chǎn)物也開發(fā)了一種基于重組蛋白的疫苗，其中該疫苗被設(shè)計為以3周的間隔，以2ml的量注射到豬崽體內(nèi)兩次。FortDodge有限公司通過在PCV-1病毒中表達(dá)PCV2的ORF2開發(fā)了一種嵌合體疫苗，其中該嵌合體疫苗以2ml的量一次注射到豬崽體內(nèi)。

在重組病毒的亞單位疫苗的情況中，形成病毒樣顆粒(VLP)能增加疫苗的抗原性是已知的。在酵母的情況中，已經(jīng)開發(fā)了利用釀酒酵母(S.cerevisiae)菌株中的Ty1(一種很久之前就已知的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子元件)的技術(shù)。Ty1在基因、結(jié)構(gòu)和功能上與逆轉(zhuǎn)錄病毒的核苷/核相似。在1987年報道了使用Ty1獲得的疫苗，并且當(dāng)疫苗候選基因與Ty1基因的3’區(qū)域融合并且進(jìn)行表達(dá)時，有如下優(yōu)點：不阻礙病毒樣顆粒的形成并且可在細(xì)胞中形成病毒樣顆粒，而不需要其它分離的因子。有幾篇報道指出：當(dāng)在酵母中生產(chǎn)疫苗時，酵母細(xì)胞壁組分還可用作佐劑(ChanGC,ChanWK,SzeDM.2009,Theeffectsofbeta-glucanonhumanimmuneandcancercells.JHematolOncol2:25)。

已知的是，如果裂解酵母細(xì)胞以提取在細(xì)胞中表達(dá)的抗原，則在制備細(xì)胞裂解液之后，諸如病毒樣顆粒的抗原難以穩(wěn)定地保持在溶液中。此外，還可能需要各種添加劑(例如，諸如聚山梨醇酯20的表面活性劑，諸如蔗糖、海藻糖或山梨糖醇的糖，等等)，來防止病毒樣顆粒發(fā)生聚集和沉淀(LangR,WinterG,VogtL,ZuercherA,DorigoB,SchimmeleB(2009))。被開發(fā)用來克服上述缺點的使用酵母全細(xì)胞的重組疫苗可享有酵母能表達(dá)一種或多種抗原、具有高穩(wěn)定性并且還易于進(jìn)行大量生產(chǎn)的優(yōu)點。

本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，表達(dá)豬圓環(huán)病毒抗原ORF2的酵母全細(xì)胞疫苗具有非常高的免疫原性，從而完成了本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

技術(shù)問題

本發(fā)明的目標(biāo)是提供一種表達(dá)重組載體的酵母全細(xì)胞，或該細(xì)胞的裂解液，包括細(xì)胞或其裂解液的豬圓環(huán)病毒疫苗組合物，以及它們的生產(chǎn)方法，其中重組載體包括編碼豬圓環(huán)病毒的II型衣殼蛋白的基因ORF2。

技術(shù)方案

在本發(fā)明的一個實施方式中，提供了一種用于豬圓環(huán)病毒疫苗的酵母全細(xì)胞，所述酵母全細(xì)胞包括豬圓環(huán)病毒的II型衣殼蛋白ORF2。在該實施方式中，基因ORF2可以是由SEQIDNO:1表示的基因。酵母用作宿主細(xì)胞，并且可以是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的菌株。具體地，所述酵母可以是Y2805菌株。此外，所述酵母全細(xì)胞可經(jīng)熱滅活或者經(jīng)福爾馬林滅活。

在本發(fā)明的另一實施方式中，提供了一種用于豬圓環(huán)病毒疫苗的酵母全細(xì)胞的裂解液，所述酵母全細(xì)胞的裂解液包括豬圓環(huán)病毒的II型衣殼蛋白ORF2。基因ORF2可以是由SEQIDNO:1表示的基因。酵母用作宿主細(xì)胞，并且可以是釀酒酵母Saccharomycescerevisiae的菌株。具體地，所述酵母可以是Y2805菌株。此外，所述酵母全細(xì)胞可經(jīng)熱滅活或者經(jīng)福爾馬林滅活，并且所述酵母全細(xì)胞的裂解液可來源于經(jīng)熱滅活或經(jīng)福爾馬林滅活的酵母全細(xì)胞。