[發明專利]使用HLA標志物測定母體血液中的胎兒DNA的分數的方法

在審

• 申請號: 201480026232.2
• 申請日: 2014-05-07
• 公開（公告）號: CN105189787A
• 公開（公告）日: 2015-12-23
• 發明（設計）人: H.A.厄利克;B.霍格倫;C.霍爾康布;P.蒙薩米;N.牛頓;M.拉斯特羅;A.詹;N.肖恩布倫納
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 權陸軍;黃希貴

1997年在母體血液中發現無細胞胎兒DNA已經開啟了非侵襲性產前診斷和篩選的新領域。循環胎兒DNA的用途包括Rh組基因分型以及篩選非整倍性和單基因疾病，綜述于Jiang,P.,等人(2012)FetalQuant:deducingfractionalfetalDNAconcentrationfrommassivelyparallelsequencingofDNAinmaternalplasma,Bioinformatics28:2883。此類診斷應用需要母體循環中存在的總DNA內的胎兒DNA的分數(也被稱為“胎兒分數”)的知識。對于一些應用，這將是僅僅質量控制問題。例如，由CLIA實驗室提供的一些目前的商業非侵襲性產前診斷(NIPD)測試表明，如果母體血漿中的DNA的<4%是胎兒的，則測試結果將是無法得出結論的，所以不運行測試。對于其他應用，諸如非整倍性和隱性等位基因的拷貝數的檢測，胎兒分數的精確測定是必需的。

目前定量母體血漿中的胎兒DNA的方法涉及檢測Y染色體基因座(例如，SRY或DYS14，美國專利號6,258,540)；檢測胎兒表觀遺傳標志物(例如，基因乳腺絲抑蛋白、RASSF1A和SERPINB2的甲基化模式，綜述于Hahn,S.,等人,(2011)Cell-freenucleicacidsaspotentialmarkersforpreeclampsia,Placenta,32:s17)；或希望發現可以區分母本DNA與胎兒DNA的有信息的單核苷酸多態性(SNP)，而靶向大量的染色體基因座(美國申請系列號12/644,388)。基于Y-染色體的方法的明顯缺點是其不適用于女性胎兒。由于缺乏可重復性，表觀遺傳方法是不佳的。使用多個SNP的方法(例如，Jiang，等人，同上)在整個基因組尋找有信息的SNP中需要復雜數學分析。測定胎兒分數的更可預測且精確的方式是期望的。

發明概述

本發明是測定樣品中胎兒核酸的分數的方法，其包括：定量檢測所述樣品中的至少一種非母本HLA等位基因；定量檢測所述樣品中在相同基因座的至少一種母本HLA等位基因；使用上述檢測的量，測定所述樣品中胎兒核酸的分數。在一些實施方案中，所述測定步驟包括計算步驟中測定的所述非母本HLA等位基因的量與所有HLA等位基因的量的總和的比率的2倍。在一些實施方案中，所述至少一種非母本和母本HLA等位基因選自HLA-A、HLA-B、HLA-C、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1等位基因、或HLA-A，外顯子2和3；HLA-B，外顯子2和3；HLA-C，外顯子2和3；DQA1，外顯子2；DQB1，外顯子2和3；DPA1，外顯子2；DPB1，外顯子2；DRB1，外顯子2；DRB3，外顯子2；DRB4，外顯子2；和DRB5，外顯子2或來自所述HLA基因的內含子序列或來自所述基因的外顯子和內含子序列的組合。在一些實施方案中，所述HLA等位基因通過包括以下的方法定量檢測：測序，具體而言克隆測序和任選包括克隆擴增的步驟。在一些實施方案中，所述克隆擴增步驟用正向引物和反向引物進行，各引物包含銜接序列和HLA-雜交序列。在一些實施方案中，所述方法包括在測序之前的目標富集步驟，例如，通過至少一輪基因組DNA擴增或通過目標捕獲。在一些實施方案中，所述HLA等位基因通過包括以下的方法定量檢測：用正向引物和反向引物擴增，以獲得HLA擴增子；進行克隆測序以測定HLA擴增子的序列；鑒定在相同基因座的至少一種母本HLA等位基因和至少一種非母本HLA等位基因；比較母本和非母本HLA序列克隆的數目，從而測定所述樣品中胎兒核酸的分數。在一些實施方案中，所述鑒定步驟包括以下計算步驟：將在所述HLA基因座的序列與HLA序列數據庫進行比較；將所述序列分選至對應于已知HLA等位基因的多個箱(bins)；將一個或兩個多數序列鑒定為母本等位基因；將一個或兩個最代表的少數序列鑒定為非母本等位基因。在一些實施方案中，所述比較步驟包括計算所述鑒定步驟中鑒定的在相同基因座的所述非母本HLA等位基因與HLA等位基因的總數的比率的兩倍。在一些實施方案中，測定HLA擴增子的序列包括邊合成邊測序(sequencingbysynthesis)。在一些實施方案中，在兩個、三個或更多個基因座(例如，DPB1、DQB1和DRB1)檢測在相同基因座的所述非母本HLA等位基因和所述母本HLA等位基因。在一些實施方案中，在相同反應體積中通過多重PCR同時擴增在兩個、三個或更多個基因座的所述非母本和母本HLA等位基因。在一些實施方案中，所述HLA等位基因通過包括數字PCR的方法定量檢測。在一些實施方案中，所述HLA等位基因通過包括以下的方法定量檢測：將所述樣品分成多個反應體積，各自包含零至近似五個拷貝的目標HLA等位基因；測定各反應體積中目標HLA等位基因的存在；將含有所述非母本HLA等位基因的反應體積的數目與含有在相同基因座的母本HLA等位基因的反應體積的數目進行比較，從而測定所述樣品中胎兒核酸的分數。在本實施方案的變型中，所述測定包括通過數字PCR擴增。在一些實施方案中，所述方法進一步包括獨立獲得在至少一個HLA基因座的父母一方或雙方的基因型信息。