[發明專利]使用HLA標志物測定母體血液中的胎兒DNA的分數的方法

在審

• 申請號: 201480026232.2
• 申請日: 2014-05-07
• 公開（公告）號: CN105189787A
• 公開（公告）日: 2015-12-23
• 發明（設計）人: H.A.厄利克;B.霍格倫;C.霍爾康布;P.蒙薩米;N.牛頓;M.拉斯特羅;A.詹;N.肖恩布倫納
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 權陸軍;黃希貴

1.測定血液或血漿樣品中胎兒核酸的分數的方法，其包括：

(a)定量檢測所述樣品中的至少一種非母本HLA等位基因；

(b)定量檢測所述樣品中在相同基因座的至少一種母本HLA等位基因；

(c)使用步驟(a)和(b)中檢測的量，測定所述樣品中的胎兒核酸的分數。

2.權利要求1的方法，其中所述測定步驟包括計算步驟(a)中檢測的所述非母本HLA等位基因的量與步驟(a)和(b)中測定的HLA等位基因的量的總和的比率的2倍。

3.權利要求1或2中任一項的方法，其中所述至少一種非母本和母本HLA等位基因包含選自以下的序列：HLA-A，外顯子2和3；HLA-B，外顯子2和3；HLA-C，外顯子2和3；DQA1，外顯子2；DQB1，外顯子2和3；DPA1，外顯子2；DPB1，外顯子2；DRB1，外顯子2；DRB3，外顯子2；DRB4，外顯子2；和DRB5，外顯子2或來自所述HLA基因的內含子序列或來自所述基因的外顯子和內含子序列的組合。

4.權利要求1至3中任一項的方法，其中所述HLA等位基因通過包括以下的方法定量檢測：測序，具體而言克隆測序。

5.權利要求4的方法，其進一步包括在測序之前的目標富集步驟，且其中所述目標富集步驟包括至少一輪基因組DNA擴增或目標捕獲。

6.權利要求1至5中任一項的方法，其中所述HLA等位基因通過包括以下的方法定量檢測：

(a)用正向引物和反向引物擴增，以獲得HLA擴增子；

(b)進行克隆測序以測定步驟(a)中獲得的HLA擴增子的序列；

(c)鑒定在相同基因座的至少一種母本HLA等位基因和至少一種非母本HLA等位基因；

(d)比較步驟(c)中鑒定的母本和非母本HLA序列克隆的數目，從而測定所述樣品中的胎兒核酸的分數。

7.權利要求6的方法，其中步驟(c)中的鑒定包括以下計算步驟：

(a)將在所述HLA基因座的序列與HLA序列數據庫進行比較；

(b)將所述序列分選至對應于已知HLA等位基因的多個箱；

(c)將一個或兩個多數序列鑒定為母本等位基因；

(d)將一個或兩個最代表的少數序列鑒定為非母本等位基因。

8.權利要求1至3中任一項的方法，其中所述HLA等位基因通過包括數字PCR的方法定量檢測。

9.權利要求1至3中任一項的方法，其中所述HLA等位基因通過包括以下的方法定量檢測：

(a)將所述樣品分成多個反應體積，各自包含零至近似五個拷貝的目標HLA等位基因；

(b)測定各反應體積中目標HLA等位基因的存在；

(c)將含有所述非母本HLA等位基因的反應體積的數目與含有在相同基因座的母本HLA等位基因的反應體積的數目進行比較，從而測定所述樣品中的胎兒核酸的分數。

10.權利要求1至9中任一項的方法，其進一步包括獨立獲得在至少一個HLA基因座的父母一方或雙方的基因型信息。

11.檢測胎兒中的染色體異常的方法，其包括：

(a)提供來自懷有所述胎兒的母親的血液樣品；

(b)通過包括以下的方法測定所述樣品中胎兒核酸的分數：定量檢測所述樣品中的至少一種非母本HLA等位基因；定量檢測所述樣品中在相同基因座的至少一種母本HLA等位基因；比較所述母本和非母本HLA等位基因的量，從而測定所述樣品中的胎兒核酸的濃度；

(c)定量檢測所述樣品中的來自懷疑異常的至少一個染色體的基因座；

(d)確定步驟(c)中檢測的染色體基因座是否以相對于步驟(b)中測定的胎兒DNA的濃度的異常量存在，從而檢測染色體異常。

12.權利要求11的方法，其中所述至少一種非母本HLA等位基因選自HLA-A，外顯子2和3；HLA-B，外顯子2和3；HLA-C，外顯子2和3；DQA1，外顯子2；DQB1，外顯子2和3；DPA1，外顯子2；DPB1，外顯子2；DRB1，外顯子2；DRB3，外顯子2；DRB4，外顯子2；和DRB5，外顯子2或來自所述基因的外顯子和內含子序列的組合。