[發明專利]新型葡糖氧化酶變體

有效

• 申請號: 201480023331.5
• 申請日: 2014-04-17
• 公開（公告）號: CN105209611B
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發明（設計）人: R·烏斯塔夫;R·普羅登諾威克;R·費希爾
• 申請（專利權）人: 弗勞恩霍夫應用研究促進協會
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12Q1/00;C12Q1/54
• 代理公司: 北京林達劉知識產權代理事務所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

本文提供的技術涉及具有改進性質的新型微生物葡糖氧化酶變體，更具體地涉及具有葡糖氧化酶活性作為其主要酶活性的多肽；涉及編碼所述葡糖氧化酶的核酸分子；含有該核酸的載體和宿主細胞和用于生產該葡糖氧化酶的方法；包括所述葡糖氧化酶的組合物；用于制備和生產此類酶的方法；以及涉及使用此類酶用于食品飼料加工的方法、用于測量臨床樣品和生物反應器中的游離葡萄糖的方法和開發微型生物燃料電池的方法。

技術領域

本文提供的技術涉及具有改進性質的微生物葡糖氧化酶的新變體，更具體地涉及具有葡糖氧化酶活性作為其主要酶活性的多肽；涉及編碼所述葡糖氧化酶的核酸分子；含有該核酸的載體和宿主細胞和用于生產該葡糖氧化酶的方法；包括所述葡糖氧化酶的組合物；用于制備和生產此類酶的方法；以及涉及使用此類酶用于食品飼料加工的方法、用于測量臨床樣品和生物反應器中的游離葡萄糖的方法和開發微型生物燃料電池的方法。

背景技術

葡糖氧化酶(β-D-葡萄糖:氧1-氧化還原酶；EC 1.1.2.3.4)通過利用分子氧作為電子受體催化β-D-葡萄糖氧化成葡糖酸，同時產生過氧化氫。微生物葡糖氧化酶近來因其在化學、藥物、食品、飲品、臨床化學、生物技術和其它工業領域的多樣化應用而備受關注。近年來對葡糖氧化酶在生物傳感器中的新應用的需求增強。葡糖氧化酶已從各種微生物來源中分離。

黑曲霉(Aspergillus niger)的葡糖氧化酶被用在例如食品加工和制藥工業中，并且用作醫學診斷領域中免疫測定和生物傳感器的組分。該酶還用于制造可為生物醫學植入物如生物傳感器和胰島素泵供能的微型生物燃料電池。這些裝置的輸出受到葡糖氧化酶在陽極室內性能的限制。

特別地，生物燃料電池領域中涉及三種酶學性質：(1)從電極向酶的電子轉移速率(固有酶活性)；(2)酶在生理條件(pH 7.4和5mM葡萄糖)下的活性；和(3)酶的熱穩定性。

WO89/126675記載了重組體系中從黑曲霉生產葡糖氧化酶，WO2008/079227 A1涉及賦予了改進的儲存穩定性的從黑曲霉獲得的葡糖氧化酶組合物。已公開了不同來源的葡糖氧化酶，包括海藻類如角叉菜(Chondrus crispus)(US 7544795,US 6924366)、絲狀真菌如枝孢菌屬(Cladosporium spp.)(WO 95/29996,WO 1998/020136,US 5834280)和黃藍狀菌(Talaromyces flavus)(US 6054318)。WO2012/017008 A1公開了與野生型葡糖氧化酶相比具有改變的酶促效率的黑曲霉葡糖氧化酶的變體。

然而，獲得具有針對眾多應用的性質改進的葡糖氧化酶將是非常有利的。

發明內容

根據本公開的改進的葡糖氧化酶可用于包括從食品和飲品中除去氧、生成過氧化氫用于防腐、臨床樣品和生物反應器中游離葡萄糖的測定以及微型生物燃料電池的開發在內的諸多應用。因此多種工業過程能夠受益于根據本公開的葡糖氧化酶的改進變體的使用。

第一方面，本公開的實施方案提供具有葡糖氧化酶活性的多肽，其中所述多肽包括在對應于來自黑曲霉的野生型葡糖氧化酶(SEQ ID NO:1)的氨基酸殘基T30、I94、A162位置處的變異，和在對應于氨基酸殘基M556、R537、R37、V106、V293或E310位置處的至少一個或多個其它變異，和其中所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO：1的氨基酸序列至少具有至少80％的最小序列同一性百分比和/或同源性百分比。

在另一方面，本公開的實施方案涉及選自由下述組成的組的核酸分子：

a)編碼根據權利要求1至15任一項所述的多肽的核酸分子；

b)編碼其中一個或多個氨基酸殘基被保守性取代的根據權利要求1至15任一項所述的多肽的核酸分子；