[發明專利]D?阿洛酮糖3?表異構酶突變體、重組載體和微生物、生產D?阿洛酮糖的方法和反應器

有效

• 申請號: 201480023014.3
• 申請日: 2014-04-23
• 公開（公告）號: CN105164255B
• 公開（公告）日: 2018-03-20
• 發明（設計）人: 曺永門;金昌謙;李白碩
• 申請（專利權）人: CJ第一制糖株式會社
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/77;C12N1/21
• 代理公司: 北京同立鈞成知識產權代理有限公司11205
• 代理人: 陶敏,臧建明

技術領域

本發明涉及一種D-阿洛酮糖3-表異構酶突變體；一種重組載體，其包含編碼所述突變體的基因；以及一種微生物，其包含所述突變體。此外，本發明涉及一種使用所述酶突變體或所述微生物來制備D-阿洛酮糖的方法。

背景技術

D-阿洛酮糖(D-psicose)是一種已知為稀有糖(rare sugar)的單糖，因為其很少見于天然材料中或少量存在。D-阿洛酮糖具有超低能量和類似于糖的甜味，并且因此廣泛用作功能性甜味劑。

D-阿洛酮糖是D-果糖(D-fructose)的差向異構體，并且具有極類似于D-果糖的甜度和味道。不同于D-果糖，D-阿洛酮糖幾乎不在體內代謝，并且具有幾乎零卡路里。D-阿洛酮糖可以用作減肥食品的高效成分，因為D-阿洛酮糖能夠抑制參與脂質合成的酶的活性并且減少腹部肥胖。此外，廣泛用作糖替代物的如木糖醇等的糖醇當大量食用時可能具有副作用，如造成腹瀉。相反，D-阿洛酮糖已知實質上不具有副作用。

出于這種原因，D-阿洛酮糖吸引了作為節食甜味劑的高度關注，并且在食品工業中日益需要一種高效生產D-阿洛酮糖的方法。因此，隨著開發D-阿洛酮糖的需要增加，已經作出各種嘗試，以便使用現有生物方法從D-果糖生產D-阿洛酮糖。作為能夠將D-果糖轉化成D-阿洛酮糖的酶，已知衍生自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的D-阿洛酮糖3-表異構酶(D-psicose 3-epimerase，DPE)和衍生自菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii)或類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)的塔格糖表異構酶。已知D-阿洛酮糖3-表異構酶具有比塔格糖表異構酶更高的活性。

在生產D-阿洛酮糖時，隨著反應溫度升高，生產更多D-阿洛酮糖。然而，在野生型D-阿洛酮糖3-表異構酶用于生產D-阿洛酮糖的情況下，酶在約50℃或更高的反應溫度下變性，這降低酶活性，由此造成生產的D-阿洛酮糖量減少的問題。因此，為了以高效用高效生產D-阿洛酮糖，迫切需要一種具有改良的耐熱性的D-阿洛酮糖3-表異構酶突變體。

發明內容

技術問題

本發明人知道了衍生自根癌土壤桿菌的D-阿洛酮糖3-表異構酶歸因于低熱穩定性盡管有高活性而具有不良效用的問題，因此開發一種具有改良的熱穩定性的D-阿洛酮糖3-表異構酶突變體，以及使用這種突變體連續生產D-阿洛酮糖的方法，以便當前作為重要食品添加劑吸引了關注的D-阿洛酮糖工業上大規模地生產。

具體來說，本發明旨在提供一種具有改良的熱穩定性的D-阿洛酮糖3-表異構酶突變體，其通過取代野生型D-阿洛酮糖3-表異構酶的氨基酸序列的特定位置處的氨基酸進行。

另外，本發明旨在提供一種多核苷酸，其編碼具有改良的熱穩定性的D-阿洛酮糖3-表異構酶突變體。

此外，本發明旨在提供一種重組載體，其包含編碼D-阿洛酮糖3-表異構酶突變體的基因。

此外，本發明旨在提供一種重組微生物，其經轉型以生產D-阿洛酮糖3-表異構酶突變體。

此外，本發明旨在提供一種使用D-阿洛酮糖3-表異構酶突變體或經轉型以生產D-阿洛酮糖3-表異構酶突變體的重組微生物來從D-果糖制備D-阿洛酮糖的方法。

技術解決方案

本發明提供一種具有改良的熱穩定性的D-阿洛酮糖3-表異構酶突變體，以高效生產D-阿洛酮糖，其通過取代野生型D-阿洛酮糖3-表異構酶的氨基酸序列的特定位置處的氨基酸進行。

具體來說，本發明提供一種D-阿洛酮糖3-表異構酶突變體，其包含如下氨基酸序列，其中衍生自根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的野生型D-阿洛酮糖3-表異構酶的氨基酸序列的位置77處的谷氨酸經脯氨酸取代。

所述突變體可以包含如下氨基酸序列，其中野生型D-阿洛酮糖3-表異構酶的氨基酸序列的位置33處的異亮氨酸進一步經由以下所構成的族群中選出的氨基酸取代：亮氨酸、半胱氨酸以及纈氨酸，和/或野生型D-阿洛酮糖3-表異構酶的氨基酸序列的位置213處的絲氨酸進一步經半胱氨酸取代。

所述突變體可以包含如下氨基酸序列，其中野生型D-阿洛酮糖3-表異構酶的氨基酸序列的位置33處的異亮氨酸進一步經亮氨酸取代，并且野生型D-阿洛酮糖3-表異構酶的氨基酸序列的位置213處的絲氨酸進一步經半胱氨酸取代。