[發(fā)明專利]用于基于納米結(jié)構(gòu)的核酸測序的方法和組合物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480022008.6
• 申請日: 2014-02-20
• 公開（公告）號: CN105308062A
• 公開（公告）日: 2016-02-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: T.科特塞羅格洛;S.帕帕德米特里奧
• 申請（專利權(quán)）人: 伊芙生物醫(yī)學(xué)股份有限公司
• 主分類號: C07H19/04
• 分類號: C07H19/04;C07H19/20;C07H21/00
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 張文輝

對相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求對2013年2月20日提交的美國申請流水號61/766,925的權(quán)益。

發(fā)明領(lǐng)域

本公開一般涉及核酸測序系統(tǒng)和方法以及可用于這類系統(tǒng)和方法中的組合物。

發(fā)明背景

納米結(jié)構(gòu)DNA測序是一種DNA測序方法，能產(chǎn)生性價比高的、長讀段和準(zhǔn)確的全人基因組測序和有效的細(xì)菌基因組測序以及其他測序應(yīng)用。本公開提供對現(xiàn)有納米結(jié)構(gòu)測序技術(shù)的大量改進(jìn)并解決限制基于納米結(jié)構(gòu)的測序方法在例如臨床應(yīng)用和高通量環(huán)境中使用的許多限制。

發(fā)明概述

基于納米結(jié)構(gòu)的測序依賴于相對于納米結(jié)構(gòu)附近的固體表面固定化的聚合酶。作為通過聚合酶的堿基摻入和延伸的結(jié)果，核酸在酶聚合酶內(nèi)移位(translocate)，并因此經(jīng)過納米結(jié)構(gòu)、在納米結(jié)構(gòu)上面或納米結(jié)構(gòu)上方通過(through,on,oroverthenanostructure)。作為酶依賴性移位的結(jié)果，觀察到跨越納米結(jié)構(gòu)的電信號中的變化。本文中描述的測序方法涵蓋兩個辦法。第一個辦法是逐個堿基測序，其中已知的堿基添加導(dǎo)致單堿基聚合和經(jīng)過納米結(jié)構(gòu)、在納米結(jié)構(gòu)上面或通過納米結(jié)構(gòu)上方移位(即移動)。在第二個辦法中，存在所有4種核苷酸，其中一種核苷酸以速率限制量存在。在4種核苷酸的3種核苷酸通過聚合酶摻入和隨后延伸期間，核酸經(jīng)過納米結(jié)構(gòu)、在納米結(jié)構(gòu)上面或通過納米結(jié)構(gòu)上方的移動以酶的正常速率進(jìn)行。然而，在核酸內(nèi)對應(yīng)于速率限制性核苷酸的位置處，延伸/移位和因而經(jīng)過納米結(jié)構(gòu)、在納米結(jié)構(gòu)上面或通過納米結(jié)構(gòu)上方的移動減速或中止。與速率限制性濃度的每種核苷酸的重復(fù)反應(yīng)允許從生物信息學(xué)上組裝完整的測序。

在一個方面，提供測定靶核酸分子的序列的方法。這類方法典型地包括在測序條件下使聚合酶與靶核酸分子接觸，其中測序條件包括至少一種核苷三磷酸的存在，其中所述聚合酶固定化于固體基片上；檢測所述靶核酸分子和/或一個或多個新生鏈經(jīng)過納米結(jié)構(gòu)、在納米結(jié)構(gòu)上面或通過納米結(jié)構(gòu)上方的移動；將所述接觸和檢測步驟重復(fù)多次；并在所述至少一種核苷三磷酸存在的情況下，序貫地基于移動中變化的存在或缺乏來測定所述靶核酸分子的序列。在一些實施方案中，測序條件包括單一核苷三磷酸的存在。在一些實施方案中，測序條件包括四種核苷三磷酸的存在，其中所述四種核苷三磷酸中的第一種核苷三磷酸以速率限制量存在。

代表性的固體基片是玻璃。在一個實施方案中，所述聚合酶是RNA聚合酶。代表性的RNA聚合酶包括，例如噬菌體RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶和T3RNA聚合酶)和細(xì)菌RNA聚合酶(例如大腸桿菌RNA聚合酶)。在一個實施方案中，所述聚合酶是DNA聚合酶。代表性DNA聚合酶包括，例如phi29DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶。在一些實施方案中，聚合酶經(jīng)由His標(biāo)簽或經(jīng)由一個或多個生物素-鏈霉親合素鍵固定化于固體表面上。

在一些實施方案中，所述靶核酸分子是真核生物的。所述靶核酸分子可以是雙鏈或單鏈的。在一些實施方案中，所述靶核酸分子包含在生物學(xué)樣品中或作為其一部分。在一些實施方案中，所述靶核酸分子包含聚合酶啟動子序列。在一些實施方案中，所述靶核酸分子還包含磁性標(biāo)簽。

代表性納米結(jié)構(gòu)包括，例如生物納米結(jié)構(gòu)、固態(tài)納米結(jié)構(gòu)或其組合。在一些實施方案中，檢測步驟包括測量經(jīng)過納米結(jié)構(gòu)、在納米結(jié)構(gòu)上面或通過納米結(jié)構(gòu)上方的電流中的變化和/或測量納米結(jié)構(gòu)的離子導(dǎo)電中的變化。檢測步驟還可以包括捕獲基于CMOS的制備的納米結(jié)構(gòu)和電子設(shè)備(electronics)上的移動。在一些實施方案中，所述方法還包括對所述靶核酸分子應(yīng)用定向力。在一些實施方案中，用磁體產(chǎn)生所述定向力。在一些實施方案中，用流或壓力產(chǎn)生所述定向力。