[發(fā)明專利]人類胰脂肪酶活性的測定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480015794.7
• 申請日: 2014-04-17
• 公開（公告）號: CN105164273B
• 公開（公告）日: 2017-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 植田成;酒瀬川信一
• 申請（專利權(quán)）人: 旭化成制藥株式會社
• 主分類號: C12Q1/44
• 分類號: C12Q1/44
• 代理公司: 北京三友知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11127
• 代理人: 丁香蘭,李洋

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及臨床檢驗領(lǐng)域中的試樣中的人類胰脂肪酶活性的測定方法和試劑盒。

背景技術(shù)

人類胰脂肪酶作為急性胰腺炎等胰臟疾病的診斷標(biāo)志物是重要的，對血清中的酶活性進行測定的試劑以臨床檢驗藥的形式市售。該酶活性測定時的最佳氫離子指數(shù)(pH)根據(jù)所使用的底物或反應(yīng)條件的不同而不同，但據(jù)報告大致為7.5至10的范圍(例如參見非專利文獻1)。作為人類胰脂肪酶的酶學(xué)特征，可以舉出：在包含底物的乳液或膠束的界面產(chǎn)生反應(yīng)；酶的活化需要膽汁酸和被稱為輔脂酶的分子量為約1lkDa的蛋白質(zhì)。在不存在膽汁酸和輔脂酶時，胰脂肪酶的活性中心被稱作蓋子(lid)的結(jié)構(gòu)域覆蓋，無法與底物接觸。膽汁酸對于乳液或膠束的形成有影響，進而，由于輔脂酶的存在，人類胰脂肪酶的立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使底物能夠結(jié)合在人類胰脂肪酶的活性中心，進而使人類胰脂肪酶顯示出活性。如此，已知人類胰脂肪酶在包含疏水性的底物、膽汁酸鹽、以及輔脂酶的復(fù)合體的界面處發(fā)揮作用。

以往，在試樣中的人類胰脂肪酶的活性測定中，作為其底物，使用甘油三脂。甘油三脂以所謂乳液的形態(tài)進行使用，該乳液是通過與阿拉伯膠或聚乙烯醇等進行強制攪拌而在緩沖液中乳化分散來形成的。在使用甘油三脂底物測定脂肪酶活性時，例如利用堿滴定法對于通過脂肪酶反應(yīng)生成的脂肪酸進行定量。此外還嘗試通過酶法對于經(jīng)脂肪酶反應(yīng)從甘油三脂底物中游離出的脂肪酸進行測定，但由于甘油三脂底物具有乳液所致的強濁度，因而難以使用酶共軛體系進行脂肪酶活性的分光學(xué)測定。此外還具有乳液底物由于保存而容易產(chǎn)生相分離的缺點，難以再現(xiàn)性良好地對脂肪酶活性進行測定。為了解決這種使用甘油三脂底物的方法中的課題，開發(fā)出了在底物中使用甘油二酯的方法(例如參見專利文獻1、2)、使用合成底物的方法(例如參見非專利文獻2)，這些方法目前在日常檢査法中使用。

作為在底物中使用甘油二酯的優(yōu)點，可以舉出：由于其親水性高于甘油三脂，因而通過與表面活性劑組合，使得底物變得澄清，具有能夠適應(yīng)于通用的自動分析裝置的便利性。

作為甘油二酯底物，主要使用1,2-甘油二酯。已知1,2-甘油二酯通過分子內(nèi)酯鍵的轉(zhuǎn)移反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成1,3-甘油二酯，在使用時要盡量不出現(xiàn)該變化。還有人提出將1,2-甘油二酯的一部分轉(zhuǎn)換為1,3-甘油二酯，將該混合物以液態(tài)進行穩(wěn)定化，將其作為人類胰脂肪酶測定的底物使用(例如參見專利文獻3)。此處，有報告指出，使用甘油二酯底物的測定方法會受到脂蛋白脂肪酶以及肝脂肪酶等非胰脂肪酶的影響。此外有報告指出，在使用甘油二酯底物的測定方法中，由于受到血液中的脂蛋白脂肪酶等非胰脂肪酶或酯酶的影響，因而具有針對胰脂肪酶的特異性容易降低等弊病(例如參見專利文獻4)。人類的脂蛋白脂肪酶、肝脂肪酶等非胰脂肪酶在肝素的作用下釋放到血中。因此，在施與肝素的待測物中，無法準(zhǔn)確測定血中的胰脂肪酶活性。另一方面，在使用了合成底物的人類胰脂肪酶活性測定用日常檢査試劑中，據(jù)信不會受到脂蛋白酶、肝脂肪酶等非胰脂肪酶的影響(例如參見非專利文獻2)，但在作為脂肪酶的最佳pH的弱堿性區(qū)域合成底物難以具有穩(wěn)定性。

作為避免非胰脂肪酶的影響的方法，有報告指出，在底物中使用作為甘油二酯的1,2-二亞油酰甘油的脂肪酶活性測定用市售試劑盒中，通過將作為膽汁酸鹽使用的脫氧膽酸鈉置換為甘氨膽酸鈉而降低了非胰脂肪酶的影響(例如參見非專利文獻3)，但其詳細(xì)內(nèi)容不明確。此外，不僅在底物中使用甘油二酯的脂肪酶活性的測定方法中會受到非胰脂肪酶的影響，而且在底物中使用甘油三脂的脂肪酶活性的測定方法中也會受到非胰脂肪酶的影響，在這種情況下，也有人報告可通過將脫氧膽酸變換為甘氨膽酸來避免非胰脂肪酶的影響(例如參見非專利文獻4)。但是，如上所述，甘油三脂底物具有無法進行分光學(xué)測定和由于保存而容易產(chǎn)生相分離的缺點，因而難以再現(xiàn)性良好地測定脂肪酶活性。

現(xiàn)有技術(shù)文獻

專利文獻

專利文獻1：日本特開昭59-91898號公報(日本專利第1607890號公報)

專利文獻2：日本特開昭63-245672號公報

專利文獻3：日本專利第4836196號公報

專利文獻4：日本特開2008-307048號公報

非專利文獻

非專利文獻1：Clinical Chemistry,39：p746-756,1993

非專利文獻2：醫(yī)學(xué)と薬學(xué)(醫(yī)學(xué)與藥學(xué))，41卷3號，p489-496，1999

非專利文獻3：Clinical Chemistry,38：288-292,1992