[發明專利]融合免疫調節蛋白及其制備方法

有效

• 申請號: 201480015160.1
• 申請日: 2014-03-10
• 公開（公告）號: CN105121474B9
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 納夾拉耶·高溫答帕;瑪利亞·梅麗娜·索雷斯;卡答納斯·薩斯特里
• 申請（專利權）人: 比奧孔有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;A61K38/17
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 金海霞;楊青

1.一種制備具有雙特異結合活性的治療活性融合蛋白的方法，其中所述融合蛋白包含腫瘤靶向部分和至少一個免疫調節部分，所述免疫調節部分削弱癌細胞的免疫耐受性，其中所述腫瘤靶向部分是結合至CTLA-4或EGFR1的抗體，并且其中通過以下步驟制備所述融合蛋白：

制備編碼所述融合蛋白的密碼子優化的核苷酸序列以在CHO細胞中表達，其中所述密碼子優化的核苷酸序列被修飾為增加了CG序列；并且其中所述密碼子優化的核苷酸序列對于結合至EGFR1的抗體來說是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或者對于結合至CTLA-4的抗體來說是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，以及對于所述免疫調節部分來說是SEQ ID NO：3或7；其中結合至EGFR1或CTLA-4的抗體的重鏈的所述密碼子優化的核苷酸序列SEQ ID NO：1或5缺失用于表達在所述抗體的重鏈C末端的賴氨酸的核苷酸；

在能夠瞬時或穩定表達的CHO細胞中克隆所述融合蛋白的所述優化的序列；

在適合生長的條件下在介質中生長所述CHO細胞，并允許所述CHO細胞表達所述融合蛋白；以及

收集分泌的融合蛋白且任選地進一步純化。

2.權利要求1的方法，其中所述免疫調節部分直接或通過由SEQ ID NO：4表達的連接子連接至所述抗體的重鏈的N或C末端、所述抗體的輕鏈的N或C末端或這兩種鏈的N和C末端兩者。

3.權利要求1的方法，其中所述密碼子優化的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1、2、4和7。

4.權利要求1的方法，其中所述密碼子優化的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1、2、3和4。

5.權利要求1的方法，其中所述密碼子優化的核苷酸序列包含SEQ ID NO：5、6、3和4。

6.一種包含同源的治療活性融合蛋白的制劑，其中所述融合蛋白包含腫瘤靶向部分和至少一個免疫調節部分，其中所述腫瘤靶向部分是結合至CTLA-4或EGFR1的抗體，并且其中通過權利要求1的方法制備所述融合蛋白。

7.一種載體，所述載體包含優化的基因的核酸序列，其中所述優化的基因已經被修飾為增加了CG序列，其中所述載體包括用于編碼至少一個靶向部分、至少一個免疫調節部分和連接部分的核苷酸序列，其中所述優化的核苷酸序列選自SEQ ID NO：1-7。

8.權利要求7的載體，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1、2、4和7。

9.權利要求7的載體，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1、2、3和4。

10.權利要求7的載體，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：5、6、3和4。

11.通過權利要求1的方法制備的治療活性融合蛋白在制備用于治療受試者中的癌癥的藥物中的應用，其中所述融合蛋白包含腫瘤靶向部分和至少一個免疫調節部分，其中所述腫瘤靶向部分是結合至CTLA-4或EGFR1的抗體。

12.權利要求11的應用，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO：15、17、27或29的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

13.權利要求11的應用，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO：16、18、28或30的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

14.權利要求11的應用，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO：28或30的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：31的氨基酸序列。