[發明專利]包含RAMP功能的通用蛋白質過表達標記及其應用

有效

• 申請號: 201480014969.2
• 申請日: 2014-02-27
• 公開（公告）號: CN105143464B
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 金根重;樸愿筫;劉成煥;李鎮永;李恩檳;閔思榮
• 申請（專利權）人: 全南大學校產學協力團
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/63
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司11227
• 代理人: 苗堃,金世煜

技術領域

本發明涉及在細胞中能夠改善重組蛋白質的難表達/不表達問題的合成標記。更具體地說，通過使標記(tag)在轉錄或翻譯階段中、在目標基因的內/外部一起行動(通過tRNA的選擇誘導和再使用提供而調節翻譯速度)，從而改善雜合基因中存在宿主的稀有密碼子(rare codon)時成為問題的翻譯速度阻礙以及非均勻的蛋白質表達問題，穩定地誘導蛋白質的功能性過表達。

背景技術

有用蛋白質通常可以大致分為諸如免疫調節劑、酶抑制劑和激素之類的醫藥及諸如研究用蛋白質和診斷用蛋白質或反應添加酶之類的工業用蛋白質。在大量生產這樣的蛋白質的過程中，務必需要基因表達、培養、純化技術。特別是表達技術在生產工藝技術過程中占據最重要的部分，是判斷經濟性的核心指標，因此其是提高附加價值和效用性的主要工藝。以往為了獲得特定蛋白質，使用了如下方法：篩選出生產性高的細菌或動物細胞株，由此生產所需的蛋白質，并進行分離純化。但是，就這樣的方法而言，收率有限，且在應用于其它蛋白質的情況下，不僅無法確保相等的生產性，而且在獲得優質(形態/結構/功能上相同的蛋白質)的產品方面上存在很多問題。目前，隨著基因重組(遺傳工程學)技術的發達，普遍使用如下方法：將有用基因轉化到大腸菌或動植物細胞株等中，容易獲得大量的所需蛋白質。特別是生產性與費用有關，因此利用具有能夠在價格比較低的培養基中快速且以高濃度培養的優點的微生物(大腸菌、酵母或放線菌等單細胞)的重組蛋白質的大量生產在商業方面具有很大的優點是已為人所知的。此外，就這些宿主而言，已經查明了生理/遺傳學特性，且用于操作重組基因的有效方法和技術的發展良好。因此，由于具有能夠高效獲得目標雜合有用蛋白質的優點，成功地生產了胰島素等醫/藥用蛋白質和工業用酶等。已知，在具有相對復雜的生理/遺傳現象和調節機制的動植物宿主的情況下，需要很難的基因操作/調節過程，因此實際情況是，對于適用于生物體的醫藥用蛋白質以外的外源基因表達，利用頻率相對低。但是在利用通用的表達調節機制的情況下，能夠克服這樣的缺點，因此對于能夠同樣應用于包括原核細胞株的所有真核細胞株的表達調節法的開發或改良，正在進行大量研究。

用于生產重組蛋白質的表達系統在載體、宿主、ORF(開放讀碼框(open reading frame))水平上試圖接近工程方法，與此關聯開發的技術的原型(prototype)較為人所熟知的(Marino，M.H.，Biopharm.2(1989)18-33；Goeddel，D.V.et al.，Methods Enzymol.185(1990)3-7；Wurm，F.and Bernard，A.，Curr.Opin.Biotechnol.10(1999)156-159)。通過以這種原型技術為基礎的各種策略和技術變形，報道了很多外源基因的成功表達，但實際情況是，由于泛化邏輯的缺乏，通常要求根據特定基因重優化表達系統構成要素的一部分或者全部的過程。在這樣的過程中，利用通過強啟動子和調節因子的組合而誘導轉錄物量增加的策略和以轉錄物的二級結構、熱力學穩定性增加為主的表達策略。但是已知，這樣的策略缺乏可應用于所有蛋白質的泛化邏輯，更重要的是，仍存在與轉錄物和翻譯的蛋白質量沒有明顯的相關關系的情況頻繁發生的問題。最近，作為解決這樣的問題的對策，與蛋白質翻譯效率增加或者速度調節有關的新的表達策略被已知為可泛化的潛在邏輯。