[發(fā)明專利]校準方法、設(shè)備和計算機程序產(chǎn)品

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480012147.0
• 申請日: 2014-03-14
• 公開（公告）號: CN105264090B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: S·V·奈爾;X·王;S·K·雅馬加塔
• 申請（專利權(quán)）人: 簡·探針公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G16B30/00
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務(wù)所 11494
• 代理人: 封新琴

使用實時擴增和內(nèi)部校準調(diào)節(jié)來量化靶核酸的方法和系統(tǒng)。該辦法采用可以自外部儀器獲得的一個固定數(shù)據(jù)點，與在要校準的儀器上擴增的一種調(diào)節(jié)校準物組合，用來接近完全校準曲線。

對相關(guān)申請的交叉引用

此申請要求2013年3月15日提交的美國臨時申請No.61/792,409的權(quán)益，在此通過援引將該申請的內(nèi)容完整收入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本公開文本涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地說，本公開文本涉及使用來自實時擴增規(guī)程的結(jié)果量化多核苷酸的校準方法和系統(tǒng)。

發(fā)明背景

現(xiàn)在常規(guī)使用牽涉體外核酸擴增的動力學(xué)分析的方法來量化分析物核酸。在有時稱作“實時”擴增規(guī)程的這些規(guī)程中，在擴增規(guī)程的過程上作為時間的函數(shù)監(jiān)測核酸擴增反應(yīng)混合物中存在的擴增子的量。完全自動化的實時核酸測定法需要能夠分析在反應(yīng)期間獲取的時間依賴性數(shù)據(jù)的機器可執(zhí)行算法。在這點上，需要精確輸出核酸的量或濃度(它會產(chǎn)生觀察擴增結(jié)果)的數(shù)據(jù)處理算法。

專利文獻中已意識到與量化特定核酸靶的絕對量有關(guān)的困難。這些困難已歸于擴增過程的指數(shù)性質(zhì)及任何控制反應(yīng)速率的變量(包括引物對的長度和核苷酸序列)的小差異能引起擴增子產(chǎn)量的劇烈差異的事實。Wang等人在美國專利No.5,219,727中描述了使用擴增分析物多核苷酸的相同引物擴增的內(nèi)部標準品的使用，而且解決了與量化的特定靶核酸無關(guān)的第二套寡核苷酸引物是使用無關(guān)cDNA作為標準品所必需的事實。依照Wang等人，使用兩套無關(guān)引物的分析只能提供兩個獨立擴增反應(yīng)的相對比較，而非靶核酸濃度的絕對測量。其他人跟隨這種技術(shù)，并采用通過具有相似序列且通過用共用引物對進行擴增而類似感興趣靶的內(nèi)部標準品(參見已公布的流水號10/230,489的美國專利申請)。還有其他人描述了依賴于測定擴增效率的定量方法(參見已公布的歐洲專利申請EP 1138784)。牽涉測定對照和靶序列的擴增比的方法也已有記載(參見美國專利No.6,066,458)。

用于對實時核酸擴增結(jié)果實施內(nèi)部校準調(diào)節(jié)的最常用方法包括“運行內(nèi)”校準調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)“存儲”校準曲線。這些方法中的第一種(由McMillan等人在US 6,713,297中例示)在每次繪制校準曲線圖時需要兩種或更多種校準標準品與重復(fù)的分析物核酸平行進行常規(guī)擴增。不幸的是，這種要求在每次再校準儀器時消耗一般以試劑盒形式購買且可能是昂貴的有限試劑。第二方法(由Carrick在US 7,930,106中例示)有利地避免在每次再校準儀器時對運行多種校準物的需要，但是仍然需要(例如由試劑盒制造商或終端用戶進行)在一些點繪制完全校準曲線圖。這種技術(shù)的經(jīng)驗顯示較好的能力，當(dāng)所量化的靶以高或很高水平存在時使用一種校準標準品再生成定量結(jié)果。例如，回溯檢驗確認了使用一種具有10⁷個靶拷貝的調(diào)節(jié)校準物調(diào)節(jié)存儲的曲線有利地再生成在10⁴至10⁸個靶拷貝的范圍中幾乎相同的完全本地曲線。在這種情況中，經(jīng)過調(diào)節(jié)的曲線在輸入量10²個靶拷貝處偏離本地曲線不超過0.6log個拷貝。相反，使用一種具有10²個靶拷貝的調(diào)節(jié)校準物產(chǎn)生在輸入靶水平10³個靶拷貝處偏離0.4log個拷貝且在輸入靶水平10⁶個靶拷貝處偏離1.6log個拷貝的經(jīng)過調(diào)節(jié)的曲線。因此，使用具有高靶量的校準標準品調(diào)節(jié)存儲的曲線顯然有好處。

甚至鑒于這些有用辦法，仍然需要允許使用體外擴增技術(shù)高度精確量化核酸的自動化解決方案，其中可以以簡化方式執(zhí)行內(nèi)部校準調(diào)節(jié)。此外，會想要能夠使用一種包含低濃度的分析物多核苷酸標準品的校準標準品在要測量的靶量或濃度的完全動態(tài)范圍間實現(xiàn)精確量化。本公開文本解決這些問題。

發(fā)明概述