[發明專利]用于釋放病毒樣顆粒的方法

有效

• 申請號: 201480008914.0
• 申請日: 2014-02-14
• 公開（公告）號: CN105073131B
• 公開（公告）日: 2017-06-27
• 發明（設計）人: V.法欽格;M.斯諾
• 申請（專利權）人: 英特維特國際股份有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司72001
• 代理人: 翟建偉,萬雪松

本發明涉及用于從昆蟲細胞中釋放桿狀病毒表達的無包膜病毒的病毒樣顆粒（VLP）的方法。

目前，當對抗傳染病時，醫學嚴重依賴疫苗。此類疫苗可以是減毒活疫苗或滅活疫苗，兩者均具有其自身的優點和缺點。減毒活疫苗緊密模擬天然感染，并且因而它們觸發的免疫應答與由劇毒形式的病毒或微生物觸發的免疫應答可比較。然而，它們可能引起一些不希望的副作用，并且減毒水平是相當關鍵的。另一方面，滅活疫苗是安全的，但它們在幾種情況下不像它們的活的對應物一樣有效。

在病毒疫苗的情況下，第三類疫苗獲得越來越多的關注：所謂的基于病毒樣顆粒（VLP）的疫苗。病毒樣顆粒是在形態上緊密類似野生型病毒的顆粒。它們包含在野生型病毒上發現的所有免疫原性組分，并且它們包含以其天然組構和構象的這些組分。然而，它們不同于野生型病毒之處在于它們不能產生感染性子代病毒，因為它們缺乏病毒基因組。

因此，它們是減毒活疫苗和滅活病毒疫苗兩者的有吸引力的替代物。

VLP主要在細胞系統中體外產生。并且在許多情況下，它們在桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統中產生。這些系統具有它們能夠產生相對大量VLP的優點。

在桿狀病毒表達載體系統（BEVS）中表達的蛋白質可以是分泌的或非分泌的蛋白質。這暗示非分泌的VLP在它們可以進一步純化前首先從昆蟲細胞中釋放。用于VLP釋放的標準方法包括凍融、超聲處理、高切力機械方法、珠方法、“細胞炸彈”、使用低滲介質的滲透壓休克、去污劑的使用和酶促方法。

然而，所有這些方法均不可避免地也導致細胞破碎或裂解，并且將細胞的整個內含物：RNA、DNA、蛋白質、細胞器、細胞碎片以及（在基于桿狀病毒的系統的情況下）活的桿狀病毒釋放到周圍介質內。明確的是大多數（如果不是全部）這些組分在VLP準備用于疫苗之前必須被去除。所需純化水平暗示包括許多質量檢查的費力的多步過程。

因此，存在對將非分泌的VLP釋放到細胞培養液內的方法的明確需要，所述方法避免同時釋放細胞的全部核酸和蛋白質內含物。

本發明的目的是提供用于釋放VLP的方法，其降低或甚至避免上述問題。

本發明中提供的方法特別適合于釋放使用昆蟲細胞在桿狀病毒表達載體系統中表達的無包膜病毒的非分泌的VLP。

目前驚訝地發現一旦包含無包膜VLP的昆蟲細胞與鹽混合，則使得產生于混合的鹽的水溶液(salt in water solution)包含至少300mOsmol/L的鹽，所述鹽的陽離子選自堿金屬和堿土金屬，并且所述鹽的陰離子選自Cl^-、Br^-或I^-；細胞釋放VLP，而不釋放其全部細胞內含物。該方法尤其適合于在懸浮無載體生長時的昆蟲細胞。

這確實是非常令人驚訝的現象：根據本發明的方法明顯使得大多數細胞完整，如例如圖4中可見的。這種VLP釋放背后的機制仍不明確。

因此，本發明的第一個實施方案涉及用于從昆蟲細胞中釋放桿狀病毒表達的無包膜病毒的病毒樣顆粒（VLP）的方法，其特征在于該方法無裂解或細胞破碎步驟，并且包括將昆蟲細胞與鹽混合的步驟，其中產生于混合的鹽的水溶液包含至少300mOsmol/l的鹽，所述鹽的陽離子選自堿金屬和堿土金屬，并且所述鹽的陰離子選自Cl^-、Br^-和I^-。

為了該方法的目的，將昆蟲細胞與鹽混合，使得產生于混合的鹽的水溶液包含至少300mOsmol/l的鹽，所述鹽的陽離子選自堿金屬和堿土金屬，并且所述鹽的陰離子選自Cl^-、Br^-和I^-，應理解為包括下述步驟：將細胞培養液（其周圍流體中的昆蟲細胞）與鹽混合至在混合后所得到的鹽溶液包含至少300mOsmol/l的鹽的程度，所述鹽的陽離子選自堿金屬和堿土金屬，并且所述鹽的陰離子選自Cl^-、Br^-和I^-。

不言而喻，混合可以以不同方式完成；例如通過將固體形式的鹽加入細胞培養液中，或通過將鹽的水溶液與細胞培養液混合。