[發(fā)明專(zhuān)利]用于降低蛋白質(zhì)制劑中的聚集物含量的混合的多官能性金屬親和表面

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201480007434.2
• 申請(qǐng)日: 2014-02-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105026416A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-11-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彼得·斯坦利·加尼翁
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 新加坡科技研究局
• 主分類(lèi)號(hào): C07K1/14
• 分類(lèi)號(hào): C07K1/14;C07K1/18;B01D15/00
• 代理公司: 北京派特恩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11270
• 代理人: 武晨燕;遲姍

相關(guān)申請(qǐng)的聲明

本申請(qǐng)要求于2013年2月6日提交的U.S.61/761,653的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容以引用方式并入本文中。

背景技術(shù)

本發(fā)明涉及用于純化蛋白質(zhì)、尤其是抗體的材料。其具體涉及用于降低聚集物、尤其是包含宿主細(xì)胞染色質(zhì)殘余物(例如核小體、組蛋白和DNA)的聚集物的含量的材料。

已表明源于宿主細(xì)胞的污染物與通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)方法產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)之間自發(fā)地形成非天然的異質(zhì)聚集物(Shukla等，Biotechnol.Progr.(2008)24:1115-1121；Luhrs等，J.Chromatogr.B(2009)877:1543-1552；Mechetner等，J.Chromatogr.B(2011)879:2583-2594；Gagnon等，J.Chromatogr.A,(2011)1218:2405-2412；Gagnon,Bioprocessing?J.(2010)9(4):14-24)。這些異質(zhì)聚集物在兩個(gè)方面可被認(rèn)為是非天然的：1)組成性污染物通常是非人來(lái)源的，由活的非人宿主細(xì)胞分泌，或在非人宿主細(xì)胞死亡后裂解時(shí)釋放到培養(yǎng)基中。在活的人體中，不存在此類(lèi)非人的污染物；以及2)相比于其中死細(xì)胞組分被快速清除的人體內(nèi)系統(tǒng)，組成性污染物累積到高濃度。因此，重組產(chǎn)物暴露于在生命系統(tǒng)中通常不會(huì)出現(xiàn)的濃度的高水平的強(qiáng)相互作用性污染物。同時(shí)，高表達(dá)水平的重組蛋白質(zhì)使它們成為與這些非人的污染物非特異性締合的適合底物，有利于形成不同組成的非期望異質(zhì)聚集物。

異質(zhì)聚集物的污染性蛋白質(zhì)含量在某種程度上已通過(guò)直接靶向污染性蛋白質(zhì)(Shukla等和Gagnon等，見(jiàn)上文)以及間接通過(guò)靶向促成污染性蛋白的相應(yīng)DNA組分(Luhrs等和Gagnon，見(jiàn)上文)得以解決。已表明在一些復(fù)合物解離時(shí)出現(xiàn)了抗體聚集物水平的降低(Shukla等、Mechetner等和Gagnon，見(jiàn)上文)。已公開(kāi)了陰離子交換劑降低抗體-污染物復(fù)合物的水平的能力(Luhrs等和Gagnon等，見(jiàn)上文)，但尚未表明能夠完全清除異質(zhì)聚集物的陰離子交換處理。也已采用尺寸排阻、陽(yáng)離子交換和疏水相互作用色譜來(lái)嘗試降低異質(zhì)聚集物，但這些技術(shù)通常劣于陰離子交換(Gagnon等，見(jiàn)上文)。

與抗體形成穩(wěn)定締合物的污染物的具體來(lái)源并非總是已知的(參見(jiàn)例如Shukla等，見(jiàn)上文)。一些努力專(zhuān)注于DNA污染物，而很少注意到其它可能的污染物的具體來(lái)源(Gagnon等和Gagnon，見(jiàn)上文)。一些表明宿主污染物與抗體制劑中的聚集物的關(guān)聯(lián)性的努力特定地關(guān)注包含染色質(zhì)分解代謝產(chǎn)物的污染物(Luhrs等和Mechetner等，見(jiàn)上文)。在這些示例中，聚集可直接通過(guò)抗體對(duì)染色質(zhì)分解代謝產(chǎn)物(例如組蛋白和DNA)的免疫特異性來(lái)介導(dǎo)。已表明染色質(zhì)分解代謝產(chǎn)物還能夠通過(guò)非特異性相互作用與抗體形成穩(wěn)定復(fù)合物。因此，對(duì)不包含染色質(zhì)分解代謝產(chǎn)物的抗原具有已知免疫特異性的單克隆抗體，可與源于死的宿主細(xì)胞的細(xì)胞核的核小體、組蛋白和DNA形成具有不同類(lèi)型的高度穩(wěn)定的聚集物(Gan等，J.Chromatography?A?191(2013)33-40)。特別地，已表明染色質(zhì)分解代謝產(chǎn)物在高分子量(HMW)聚集物中有高度代表性。HMW聚集物特別值得關(guān)注，因?yàn)樗鼈円伤茀⑴c促進(jìn)治療中和性抗體的形成。HMW聚集物通常被定義為大小高于小倍數(shù)目標(biāo)抗體的聚集物。例如，2-抗體締合物不被認(rèn)為是HMW聚集物，大多數(shù)4-抗體聚集物也不是。然而，高得多的大小的聚集物(例如對(duì)應(yīng)于約8到約10或更多的抗體的聚集物)通常可被歸類(lèi)為HMW聚集物。

用預(yù)期可使異質(zhì)聚集物解離的試劑處理抗體制劑已通常被證明是無(wú)效的。例如，采用高濃度的尿素、鹽或兩者的組合不會(huì)使IgM-污染物異質(zhì)聚集物顯著解離(Gagnon等，見(jiàn)上文)。已表明采用尿素、醇和表面活性劑的預(yù)洗脫洗滌的蛋白A親和色譜比無(wú)洗滌更有效地降低異質(zhì)聚集物水平(Shukla等，見(jiàn)上文)，這與組合了尿素、鹽和EDTA與蛋白G親和色譜的預(yù)洗脫洗滌一樣(Mechetner等，見(jiàn)上文)。已表明采用尿素的預(yù)洗脫洗滌的陰離子交換色譜比無(wú)尿素洗滌更有效地降低異質(zhì)聚集物(Gagnon等，見(jiàn)上文)。也已表明采用預(yù)洗脫EDTA洗滌的陽(yáng)離子交換色譜比無(wú)所述洗滌更有效地降低異質(zhì)聚集物(Gagnon等，見(jiàn)上文)。最后，采用尿素和/或鹽的預(yù)洗脫洗滌的羥基磷灰石也比無(wú)此類(lèi)洗滌更有效地降低異質(zhì)聚集物(Gagnon，見(jiàn)上文)。雖然存在這些觀察結(jié)果，但一般來(lái)說(shuō)，在與色譜柱結(jié)合的抗體的預(yù)洗脫洗滌中使用解離劑僅獲得了適度成功。