[發明專利]固體支持物上的樣品制備

有效

• 申請號: 201480004440.2
• 申請日: 2014-01-08
• 公開（公告）號: CN104968805B
• 公開（公告）日: 2017-03-15
• 發明（設計）人: 尼爾·安東尼·葛姆雷;杰弗里·保羅·史密斯
• 申請（專利權）人: 伊魯米納劍橋有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司11262
• 代理人: 劉小立,鄭霞

相關申請

本申請要求于2013年1月9日提交的美國臨時申請號61/750,682的優先權，其在此通過引用以其整體并入。

背景

存在很多期望從雙鏈DNA(dsDNA)靶分子產生片段化并加標簽的DNA分子文庫的方法和應用。通常，目的是從大的dsDNA分子產生較小的DNA分子(例如，DNA片段)，用于用作DNA測序反應中的模板。

目前用于雙鏈DNA的片段化和加標簽用于在下一代測序中使用的很多方法浪費DNA，需要用于片段化的昂貴的設備，并且片段化、加標簽和回收加標簽的DNA片段的過程困難、冗長、費力、耗時、低效、昂貴、需要相對大量的樣品核酸。另外，這些方法中的很多產生加標簽的DNA片段，所述加標簽的DNA片段不完全代表包含于加標簽的DNA片段從其產生的樣品核酸中的序列。因此，本領域需要的是提供當從靶DNA產生加標簽的DNA片段文庫時快速且方便使用的方法，其能容易地應用到核酸分析方法，諸如下一代測序和擴增方法。

概述

本文提供了用于固體支持物上的核酸樣品制備的方法和組合物。所述方法和組合物特別地涉及用于使用固定至固體支持物的轉座子組合物片段化DNA并使DNA加標簽的方法和組合物。本文提供的方法和組合物是有用的，例如，用于產生在下一代測序方法等中使用的加標簽的DNA片段文庫。在一些優選的實施方案中，本發明涉及在固體支持物上從來自任何來源的靶DNA制備線性ssDNA片段，用于基因組、亞基因組、轉錄組、或宏基因組分析，或RNA表達分析，所述靶DNA包括任何感興趣的dsDNA(包括從RNA制備的雙鏈cDNA)。

相應地，本發明提供了制備加標簽的DNA片段的固定的文庫(immobilized?library?of?tagged?DNA)的方法，所述方法包括：(a)提供具有轉座體復合物(transposome?complex)固定于其上的固體支持物，其中轉座體復合物包含結合至第一多核苷酸的轉座酶，所述第一多核苷酸包含(i)3'部分，所述3'部分包含轉座子末端序列，和(ii)第一標簽，所述第一標簽包含第一標簽域；和(b)在靶DNA藉以被轉座體復合物片段化，并且第一多核苷酸的3'轉座子末端序列藉以轉移至片段的至少一條鏈的5'末端的條件下，將靶DNA施加于固體支持物；從而產生雙鏈片段的固定的文庫，其中至少一條鏈是用第一標簽在5'-加標簽的。在一些實施方案中，轉座體復合物包含第二多核苷酸，所述第二多核苷酸包含與所述轉座子末端序列互補的區域。所述方法還包括(c)提供溶液中的轉座體復合物，并在靶DNA藉以被溶液中的轉座體復合物片段化的條件下使轉座體復合物與固定的片段接觸；從而獲得具有一個末端在溶液中的固定的核酸片段。在一些實施方案中，溶液中的轉座體復合物可包含第二標簽，以使得所述方法產生具有第二標簽的固定的核酸片段，所述第二標簽在溶液中。第一標簽和第二標簽可以是不同的或相同的。

本文還提供了根據以上方法或其他方法制備的具有加標簽的DNA片段的文庫固定于其上的固體支持物。例如，本文提供了具有轉座體復合物固定于其上的固體支持物，其中轉座體復合物包含結合至第一多核苷酸的轉座酶，多核苷酸包含(i)3'部分，所述3'部分包含轉座子末端序列，和(ii)第一標簽，所述第一標簽包含第一標簽域；

本文還提供了產生流通池(flowcell)的方法，包括將多個轉座體復合物固定至固體支持物，所述轉座體復合物包含結合至第一多核苷酸的轉座酶，第一多核苷酸包含(i)3'部分，所述3'部分包含轉座子末端序列，和(ii)第一標簽，所述第一標簽包含第一標簽域。

所述方法還可包括提供具有多個第一多核苷酸固定于其上的固體支持物，以及使固體支持物與轉座酶全酶和第二多核苷酸接觸，所述第二多核苷酸包含與轉座子末端序列互補的區域。在所述方法的一些實施方案中，所述固定包括(a)提供具有擴增引物偶聯至其的固體支持物；(b)使第二多核苷酸與擴增引物之一雜交，所述第二寡核苷酸包含與轉座子末端序列互補的區域，以及與第一標簽互補的區域；(c)使用聚合酶延伸擴增引物以產生包含與第二多核苷酸雜交的第一多核苷酸的雙鏈體，所述第一多核苷酸直接地固定至固體支持物；以及(d)使固體支持物與轉座酶全酶接觸，從而在固體支持物上組裝轉座體復合物。