[發(fā)明專利]高分辨率解鏈的改進校準(zhǔn)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480003348.4
• 申請日: 2014-01-08
• 公開（公告）號: CN104838017B
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: A.賴澤;G.薩格納
• 申請（專利權(quán)）人: 霍夫曼-拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務(wù)所11494
• 代理人: 岑曉東

發(fā)明背景

本發(fā)明涉及用于在高分辨率解鏈PCR實驗中進行溫度校準(zhǔn)的方法或試劑盒。本說明書進一步涉及用于最優(yōu)校準(zhǔn)的方法，其允許靶物和校準(zhǔn)物的相同或相似解鏈溫度的讀出。本說明書進一步涉及用于實施所述方法的儀器和執(zhí)行所述方法的計算機程序。

高分辨率解鏈(high resolution melting,HRM)是一種在PCR擴增后檢測靶序列中未知核酸變異的方法。與傳統(tǒng)方法例如變性梯度凝膠電泳(DGGE)相比，HRM提供用于突變掃描的幾個優(yōu)勢。這些優(yōu)勢包括較低的試劑和樣品消耗，較少的優(yōu)化步驟以及在單次實時定量PCR中可執(zhí)行的封閉測試形式。

在能夠非共價結(jié)合雙鏈核酸的特殊熒光DNA結(jié)合染料(例如480Resolight染料，Roche Applied Science，目錄號04909640001)的存在下，對長達(dá)約250個堿基對的靶序列PCR擴增后，加入生成的擴增子的HRM步驟。因為所述熒光非共價雙鏈DNA結(jié)合染料不抑制PCR，所以其可以以飽和濃度加到擴增反應(yīng)中。在HRM步驟中，所述熒光非共價雙鏈DNA結(jié)合染料被釋放，且可以檢測到野生型、純合子和雜合子突變體之間關(guān)于擴增子解鏈圖譜的差異(Reed GH,Kent JO,Wittwer CT(2007),Pharmacogenomics 8(6):597-608；Wittwer CT(2009),Hum.Mutat.30(6):857-859；Wittwer等，美國專利號7,582,429)。

根據(jù)點突變的類型，觀察到的解鏈溫度差異可能非常小。單核苷酸多態(tài)性(SNPs)通常導(dǎo)致解鏈溫度在約1.0℃(對于1類SNPs(C/T和G/A堿基改變)和2類SNP(C/A和G/T堿基改變))、約0.5℃(對于3類SNPs(C/G堿基改變))和約0.2℃(對于4類SNPs(A/T堿基改變)為約0.2℃)之間的變化。與野生型相比，雜合子突變通常表現(xiàn)出不同的熒光解鏈圖譜(解鏈曲線形狀)，而純合子突變通常導(dǎo)致與野生型非常相似的解鏈圖譜，且僅能通過較小的溫度變化區(qū)分。

關(guān)于HRM的現(xiàn)有技術(shù)展現(xiàn)出如本文下面所述的幾個缺點。為了檢測解鏈溫度中的小差異，要求測量系統(tǒng)極高的溫度精度。實時PCR儀器通常設(shè)計為基于模塊的系統(tǒng)，其使用Peltier元件進行精確溫度控制。然而，所述溫度控制受制于物理限制，其由例如溫度傳感器的校準(zhǔn)、Peltier元件的控制以及微孔板個體和加熱模塊底座的幾何契合所導(dǎo)致。這些限制通常導(dǎo)致在加熱模塊中最熱和最冷位置之間觀察到的0.5-1.0℃的溫度范圍。因此，反應(yīng)體積中的溫度控制不允許在純合突變體與其野生型相比具有非常相似的特征性解鏈圖譜(profile)的HRM實驗中區(qū)分較小的溫度變化。

為了修正在基于模塊的熱循環(huán)儀的所有位置處不均勻的溫度分布，目前建立了兩種不同的方法：

在于特定的儀器上實施HRM實驗之前，使用特殊的校準(zhǔn)板來執(zhí)行分開的溫度校準(zhǔn)運行。將所有位置的所述模塊特異性溫度數(shù)據(jù)保存于所述儀器的軟件中，并隨后用于HRM實驗來修正所有位置的溫度差異。這種方法建立用于例如Applied Biosystems 7500和7900HT實時PCR系統(tǒng)(例如HRM Calibration Plate，目錄號PN4425618)和Biorad CFX實時PCR系統(tǒng)(例如Melt Calibration Kit，目錄號184-5020)。

所述校準(zhǔn)方法的缺點在于，當(dāng)實施分開的溫度校準(zhǔn)運行時，溫度不均一的實驗特異性原因無法被修正。這些包括微孔板個體在加熱模塊底座中的不同契合，以及從底座到板和反應(yīng)體積的溫度傳遞中相關(guān)的差異。此外，例如由不同的離子強度(由純化方法或樣品材料導(dǎo)致的)導(dǎo)致的不同反應(yīng)條件影響觀察到的解鏈溫度。另外，Peltier模塊的熱老化不能通過此方法補償。

1)在HRM試驗中，內(nèi)部的溫度校準(zhǔn)物被加到每一個反應(yīng)中。所述溫度校準(zhǔn)物由未標(biāo)記的雙鏈寡核苷酸組成，其采用低于或高于所述靶序列的預(yù)期解鏈溫度的解鏈溫度，并使用在反應(yīng)中存在的熒光非共價雙鏈DNA結(jié)合染料來檢測。基于測量到的孔與孔之間校準(zhǔn)物的溫度差異，修正檢測到的目標(biāo)溫度。這一方法建立用于例如Idaho Technology的儀器(High Sensitivity Master Mix，目錄號HRLS-ASY-0008)。