[發明專利]高分辨率解鏈的改進校準

有效

• 申請號: 201480003348.4
• 申請日: 2014-01-08
• 公開（公告）號: CN104838017B
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: A.賴澤;G.薩格納
• 申請（專利權）人: 霍夫曼-拉羅奇有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所11494
• 代理人: 岑曉東

1.用于在PCR實驗中溫度校準的方法，其中所述方法包括以下步驟：

a)在多孔板的每個孔中提供用于擴增樣品中的特定靶核酸的反應混合物，其包含熒光非共價雙鏈DNA結合染料，

b)在每個孔中提供雙鏈寡核苷酸，其中供體生色團共價結合所述雙鏈寡核苷酸的第一條鏈，且其中接受體生色團共價結合所述雙鏈寡核苷酸的第二條鏈，

c)在每一個孔中擴增所述特定靶核酸，

d)在每個孔中解鏈擴增的特定靶核酸從而導致自所述熒光非共價雙鏈DNA結合染料的放射發射減少，以及解鏈所述雙鏈寡核苷酸從而導致自供體生色團的放射發射增加或自接受體生色團的放射發射減少，其通過空間分離供體生色團和受體生色團實現，

e)通過檢測自所述熒光非共價雙鏈DNA結合染料的放射發射的減少在每個孔中監控所述擴增的特定靶核酸的解鏈溫度值，并且分開地通過檢測自所述供體生色團的放射發射的增加或自所述接受體生色團的放射發射的減少在每個孔中監控所述雙鏈寡核苷酸的解鏈溫度值，

f)基于所述雙鏈寡核苷酸的解鏈溫度值的孔與孔差異，對每個孔修正所述擴增的特定靶核酸的解鏈溫度值；

其中所述熒光非共價雙鏈DNA結合染料的放射波長和所述供體生色團的放射波長彼此分開。

2.權利要求1的方法，其中所述特定靶核酸包含單核苷酸多態性。

3.權利要求1或2的方法，其中所述供體生色團共價結合所述雙鏈寡核苷酸第一條鏈中的核苷酸，所述接受體生色團共價結合所述雙鏈寡核苷酸第二條鏈中的核苷酸，其中第一條鏈中的所述核苷酸和第二條鏈中的所述核苷酸形成互補堿基對。

4.權利要求3的方法，其中所述供體生色團共價結合所述雙鏈寡核苷酸的第一條鏈的5’端，且所述接受體生色團共價結合所述雙鏈寡核苷酸的第二條鏈的3’端，或者其中所述供體生色團共價結合所述雙鏈寡核苷酸的第一條鏈的3’端，且所述接受體生色團共價結合所述雙鏈寡核苷酸的第二條鏈的5’端。

5.權利要求1-2和4中任一項的方法，其中所述熒光非共價雙鏈DNA結合染料是480Resolight染料。

6.權利要求3的方法，其中其中所述熒光非共價雙鏈DNA結合染料是 480Resolight染料。

7.權利要求1-2、4和6中任一項的方法，其中所述供體生色團是Cy5。

8.權利要求3的方法，其中所述供體生色團是Cy5。

9.權利要求5的方法，其中所述供體生色團是Cy5。

10.權利要求1-2、4、6和8-9中任一項的方法，其中所述接受體生色團是淬滅劑分子。

11.權利要求3的方法，其中所述接受體生色團是淬滅劑分子。

12.權利要求5的方法，其中所述接受體生色團是淬滅劑分子。

13.權利要求7的方法，其中所述接受體生色團是淬滅劑分子。

14.權利要求10的方法，其中所述淬滅劑分子是選自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和BHQ-4的暗淬滅劑。

15.權利要求11-13中任一項的方法，其中所述淬滅劑分子是選自BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3和BHQ-4的暗淬滅劑。

16.權利要求1-2、4、6、8-9和11-14中任一項的方法，其中所述雙鏈寡核苷酸設計為使得所述雙鏈寡核苷酸的解鏈溫度與所述擴增的特定靶核酸的解鏈溫度相差不多于5℃。

17.權利要求3的方法，其中所述雙鏈寡核苷酸設計為使得所述雙鏈寡核苷酸的解鏈溫度與所述擴增的特定靶核酸的解鏈溫度相差不多于5℃。

18.權利要求5的方法，其中所述雙鏈寡核苷酸設計為使得所述雙鏈寡核苷酸的解鏈溫度與所述擴增的特定靶核酸的解鏈溫度相差不多于5℃。

19.權利要求7的方法，其中所述雙鏈寡核苷酸設計為使得所述雙鏈寡核苷酸的解鏈溫度與所述擴增的特定靶核酸的解鏈溫度相差不多于5℃。

20.權利要求10的方法，其中所述雙鏈寡核苷酸設計為使得所述雙鏈寡核苷酸的解鏈溫度與所述擴增的特定靶核酸的解鏈溫度相差不多于5℃。