[發(fā)明專利]一種TRAIL穿膜肽樣突變體、制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201480001787.1
• 申請日: 2014-10-10
• 公開（公告）號: CN105555799B
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳守春;閆娟;徐琦;胡海洋;黃先洲;魏利佳
• 申請（專利權(quán)）人: 成都華創(chuàng)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C07K14/705
• 分類號: C07K14/705;C12N15/12;C12N15/70;C12N15/10;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 北京聯(lián)瑞聯(lián)豐知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11411
• 代理人: 曾少麗

1.一種TRAIL穿膜肽樣突變體，其特征在于，該突變體是通過選擇性地將TRAIL野生型蛋白胞膜外段第114～121位氨基酸編碼序列由VRERGPQR改造為RRRRRRRR，即第114位由纈氨酸突變?yōu)榫彼幔?16位由谷氨酸突變?yōu)榫彼幔?18位由甘氨酸突變?yōu)榫彼幔?19位由脯氨酸突變?yōu)榫彼幔?20位由谷氨酰胺突變?yōu)榫彼幔沟猛蛔凅w蛋白的N端成為連續(xù)8個精氨酸編碼序列，成為包含穿膜肽樣結(jié)構(gòu)的蛋白。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種TRAIL穿膜肽樣突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO：2。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項所述一種TRAIL穿膜肽樣突變體，其特征在于，編碼所述突變體的cDNA序列如SEQ ID NO：1。

4.一種權(quán)利要求1所述的TRAIL穿膜肽樣突變體的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

A、cDNA片段擴(kuò)增與克隆；

B、表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定；

C、重組TRAIL蛋白的融合表達(dá)；

D、TRAIL蛋白的純化；

E、TRAIL蛋白鑒定。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種TRAIL穿膜肽樣突變體的制備方法，其特征在于，步驟B中，所述表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定步驟包括：

B1、將原核表達(dá)載體中的融合標(biāo)簽序列切除；

B2、將優(yōu)化后編碼TRAIL穿膜肽樣突變體蛋白的cDNA序列克隆于原核表達(dá)載體上以獲得高效可溶性非融合表達(dá)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種TRAIL穿膜肽樣突變體的制備方法，其特征在于，步驟B1，所述原核表達(dá)載體為pET32a或pTWIN1。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種TRAIL穿膜肽樣突變體的制備方法，其特征在于，步驟C中，所述重組蛋白的表達(dá)時，誘導(dǎo)溫度為18～24℃。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種TRAIL穿膜肽樣突變體的制備方法，其特征在于，步驟D中，所述TRAIL蛋白的純化步驟包括：

D1、陽離子交換樹脂作為第一步純化以捕獲破菌后上清中的目的蛋白；

D2、羥基磷灰石樹脂作為第二步中度純化以進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)純度和去除內(nèi)毒素；

D3、采用陰離子交換樹脂作為最終步驟精細(xì)純化以使產(chǎn)品滿足工業(yè)化放大和將來臨床應(yīng)用所需。

9.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項所述一種TRAIL穿膜肽樣突變體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。