[發明專利]肝干細胞的特異性表面分子標志物CD63及其應用

有效

• 申請號: 201410857087.4
• 申請日: 2014-12-29
• 公開（公告）號: CN104531611B
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發明（設計）人: 胡以平;李思光;何志穎;陳費;張坤山;王敏君;于兵
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/071;G01N33/569;G01N33/542;A61K35/407;A61P1/16
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙)31268
• 代理人: 趙青

技術領域

本發明涉及醫藥生物工程技術領域，提供了肝干細胞的特異性表面分子標志物CD63及其應用，并通過該表面標志物從肝臟中快速分離和培養擴增肝干細胞的方法。具體涉及應用肝干細胞的表面特異性標志物，通過流式分選的方法從肝臟細胞懸液中快速分離出肝干細胞，并實現肝干細胞在體外的擴增和雙向分化，以及在肝臟疾病動物模型肝臟內的再植。

背景技術

組織干細胞是指存在于個體已經分化的組織中的未分化細胞，這種細胞具有自我更新和特化形成該組織的細胞的能力。組織干細胞存在于機體的各種組織器官中，是組織器官穩態維持的結構和功能基礎。成年個體組織中的組織干細胞在正常情況下大多處于休眠狀態，只有在病理狀態或在外界因素的作用下才能被激活增殖并向該組織的細胞類型分化。肝臟中的肝干細胞被認為存在于Hering’s管和膽管腺中，具有產生肝細胞和膽管上皮細胞的雙向分化潛能。在正常肝組織中，肝干細胞的數量極少，只有當肝臟受損并且肝細胞的增殖受到抑制或是肝臟受到持續的大規模慢性損傷時，肝臟中的肝干細胞才能被激活，即所謂的“膽管反應”。在動物模型中常聯合應用能夠抑制肝細胞增殖的藥物(如倒千里光堿、對乙酰氨基酚等)和三分之二肝切來誘導膽管反應，而在人類的慢性肝病中(如慢性病毒性肝炎、原發性膽汁性肝硬化等)常到觀察到膽管反應的存在。

肝干細胞的分離培養及其深入研究對于肝臟發育，肝臟損傷后再生、肝臟腫瘤的發生的機理以及各種原因導致的終末期肝臟疾病的細胞治療都具有十分重要的研究意義和應用價值。由于肝干細胞在肝臟中存在的數量極少，目前報道肝干細胞的分離的方法尚不完善。Li等通過千里光堿聯合2/3肝切誘導膽管反應后，將肝臟制備成細胞懸液，經過分級離心去除肝實質細胞后，再通過差速貼壁的方法將肝干細胞純化(Li WL,Su J,Yao YC,Tao XR,Yan YB,Yu HY,Wang XM,Li JX,Yang YJ,Lau JT,Hu YP,Isolation and characterization of bipotent liver progenitor cells from adult mouse,Stem Cells,24(2),322-332)，該種分離純化肝干細胞的方法比較繁瑣，且不易從正常肝組織中分離出肝干細胞。近年來，通過Foxl1，和Lgr5等肝干細胞的表面標志物結合流式或磁珠分選的方法從正常肝臟或誘導膽管反應的肝臟中分離出肝干細胞(Shin S,Walton G,Aoki R,Brondell K,Schug J,Fox A,Smirnova O,Dorrell C,Erker L,Chu AS,Wells RG,Grompe M,Greenbaum LE,Kaestner KH,Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential,Genes Dev.25(11):1185-1192；Dorrell C,Erker L,Schug J,Kopp JL,Canaday PS,Fox AJ,Smirnova O,Duncan AW,Finegold MJ,Sander M,Kaestner KH,Grompe M,Prospective isolation of a bipotential clonogenic liver progenitor cell in adult mice.Genes Dev.25(11):1193-1203；Huch M,Dorrell C,Boj SF,van Es JH,Li VS,van de Wetering M,Sato T,Hamer K,Sasaki N,Finegold MJ,Haft A,Vries RG,Grompe M,Clevers H,In vitro expansion of single Lgr5+liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration,Nature.494(7436):247-250.)，但這些標志物并不能有效區分肝干細胞和膽管細胞。因此，現有的分離肝干細胞的方法操作繁復或是分離的肝干細胞純度較低，目前尚沒有能夠快速從肝臟組織中特異分離純化肝干細胞的方法。