[發明專利]肝干細胞的特異性表面分子標志物CD63及其應用

有效

• 申請號: 201410857087.4
• 申請日: 2014-12-29
• 公開（公告）號: CN104531611B
• 公開（公告）日: 2018-01-30
• 發明（設計）人: 胡以平;李思光;何志穎;陳費;張坤山;王敏君;于兵
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第二軍醫大學
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/071;G01N33/569;G01N33/542;A61K35/407;A61P1/16
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙)31268
• 代理人: 趙青

1.CD63在肝干細胞快速分離擴增或誘導分化的方法中的應用，所述的應用是將CD63作為肝干細胞的特異性表面分子標志物，結合流式分選的方法從肝臟中分離出CD63陽性肝干細胞。

2.根據權利要求1所述的CD63在肝干細胞快速分離擴增或誘導分化的方法中的應用，其特征在于，所述肝臟是指正常肝臟或DDC誘導膽管反應后的肝臟。

3.根據權利要求1所述的CD63在肝干細胞快速分離擴增或誘導分化的方法中的應用，其特征在于，CD63在肝干細胞快速分離擴增的方法中的應用的具體步驟如下：

A、原位免疫熒光和免疫組化染色鑒定CD63陽性的肝干細胞在正常肝臟或DDC誘導膽管反應后肝臟中的定位；

B、通過流式細胞儀分選的方法，從正常肝臟或DDC誘導膽管反應后肝臟中分離出CD63陽性的肝干細胞，并實現了CD63陽性的肝干細胞在體外的擴增；首先將正常肝臟或DDC誘導膽管反應3周后的肝臟用兩步法原位膠原酶灌注消化肝臟，消化混合物繼續用0.25％膠原酶在37℃孵育30分鐘，然后通過梯度離心法富集肝臟非實質細胞；再通過流式細胞儀分選出CD11b、CD31和CD45陰性，而CD63陽性的肝干細胞；最后將CD63陽性的肝干細胞在SCM-A培養基中大量擴增；

所述SCM-A培養基為DMEM/F12、10％胎牛血清、1×青鏈霉素、0.1mM 2-巰基乙醇、1×胰島素-轉鐵蛋白-硒溶液、10ng/ml肝細胞生長因子、10ng/ml表皮生長因子、10ng/ml尼克酰胺、10^-7M地塞米松和50μg/ml慶大酶素。

4.根據權利要求3所述的CD63在肝干細胞快速分離擴增或誘導分化的方法中的應用，其特征在于，其中步驟A中原位免疫熒光和免疫組化染色鑒定CD63陽性的肝干細胞在正常肝臟或DDC誘導膽管反應后肝臟中的定位的具體步驟為：

A1、正常肝臟和DDC誘導膽管反應3周后的肝臟用OCT包埋劑包埋后，冰凍切片7μm厚；4％多聚甲醛室溫固定10分鐘，去除固定液，PBS洗三遍，4℃保存備用；

A2、免疫熒光染色：將經步驟A1處理后的肝臟切片用1％牛血清白蛋白室溫封閉30分鐘后，滴加用封閉液稀釋的鼠抗CD63抗體和兔抗CK19抗體，4℃過夜；PBS-T洗滌三次，每次5分鐘，滴加FITC標記的羊抗兔IgG和TRITC標志的羊抗鼠IgG，37℃反應30分鐘，用PBS-T洗滌3次，每次5分鐘；DAPI復染細胞核1分鐘，PBS-T洗2次；抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察；

A3、免疫組化染色：將經步驟A2處理后的肝臟切片用0.3％雙氧水封閉30分鐘，PBS-T洗三次，1％BSA室溫封閉30分鐘后，滴加用封閉液稀釋的鼠抗CD63抗體，4℃過夜；PBS-T洗滌三次，每次5分鐘；切片上滴加用PBS-T稀釋的HRP標記二抗，37℃孵育30分鐘，用PBS-T洗滌3次，每次5分鐘；切片上滴加新鮮配制的DAB染色液，鏡下觀察切片顏色變化，待顏色明顯時，立即將片子放入自來水中沖洗，終止顯色反應；DAB顯色后，蘇木精復染，脫水后封片。

5.根據權利要求3所述的CD63在肝干細胞快速分離擴增或誘導分化的方法中的應用，其特征在于，其中步驟B的具體步驟為：

B1、兩步法原位膠原酶灌注消化肝臟，消化混合物繼續用0.25％膠原酶在37℃孵育30分鐘；

B2、消化后的細胞懸液50g離心力低速離心30分鐘兩次，棄沉淀，收集上清液后，繼續用300g離心力離心5分鐘，用無血清培養基重懸細胞，計數，將細胞稀釋至10⁷/ml，使用密度梯度離心分層液富集非實質細胞；

B3、收集富集到的非實質細胞后，PBS洗兩遍，無血清培養基重懸；使用抗小鼠CD16/32抗體，每10⁶細胞1μg抗體，4℃封閉10分鐘；

B4、4℃避光孵育CD63-PE抗體，每10⁶細胞0.5μg抗體，同時孵育CD11b,CD31,CD45-FITC抗體，每10⁶細胞0.2μg抗體，20分鐘；用含有2％FBS的PBS清洗細胞三遍；

B5、使用流式儀分選，以獲得CD63-PE陽性，CD11b,CD31,CD45-FITC陰性的細胞；

B6、接種500個流式細胞儀分選出的CD63+的肝干細胞至含SCM-A的培養基的96孔板中，37℃，5％CO₂，95％濕度條件培養2周。