[發明專利]一種從血液中提取的抗氧化酶

在審

• 申請號: 201410851259.7
• 申請日: 2014-12-31
• 公開（公告）號: CN104560904A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 陳光;胡少雄;盛美田
• 申請（專利權）人: 唯美度科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;A61K8/66;A61Q19/08
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及抗氧化酶領域，具體涉及一種從血液中提取的抗氧化酶。

背景技術

抗氧化酶是一類具有重要應用價值的生物酶。其可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，復原因自由基造成的對細胞傷害，具有抗輻射、抗腫瘤及延緩機體衰老等功能，在保健品、醫藥和化妝品行業中有重要的應用價值。

目前，國內外抗氧化酶多數來源于動物血液、肝臟，現有技術對于從血液中提取抗氧化酶多有報道。專利文獻CN101338304A公開了一種從血液中提取超氧化物歧化酶的方法,其步驟是:取動物紅血球,低溫溶血破碎獲得溶血液,使用低溫乙醇及三氯甲烷去除溶血液中的血紅蛋白,使用低溫丙酮沉淀、離心獲得低等級的超氧化物歧化酶混合物,使用水浴加熱再使用低溫丙酮沉淀、離心收集超氧化物歧化酶混合物,使用磷酸鹽緩沖液和低溫丙酮多次提純獲得超氧化物歧化酶。經比較和研究可知，現有技術提供的從血液中提取抗氧化酶的方法，需要經過長時間的組織破碎或超聲破碎，對破碎勻漿物過夜靜置，過程耗時長，效率低；在去除血紅蛋白和沉淀抗氧化酶步驟中，均需要使用有機溶劑，尤其在沉淀抗氧化酶中，常需添加大量的丙酮，對環保提出了嚴峻的考驗，并且丙酮在一定程度上還會引起蛋白質活性丟失。

發明內容

本發明旨在克服現有技術存在的缺陷，提供一種從血液中提取的抗氧化酶，所述抗氧化酶具有純度高、抗氧化活性好的特點。

本發明提供了一種從血液中提取的抗氧化酶，所述抗氧化酶由包括以下步驟的方法制備而成：

1)從血液中分離血紅細胞，將洗凈后的血紅細胞與水混合，破碎血紅細胞得提取液，在所得提取液中加入氯仿和95％乙醇混合溶劑萃取，取上層溶液；將硫酸銨加入上層溶液中，靜置，離心后收集沉淀；

2)將步驟1)所得沉淀溶解于pH7.3～7.5的0.01～0.02mol/L磷酸鹽緩沖液中，將所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝膠柱Sephadex?G-25頂端，用本步驟所述磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收集含有蛋白質且不含硫酸銨的洗脫液，濃縮，備用；

3)在步驟2)所得產物中加入NaCl，使NaCl的終濃度為0.4～0.6mol/L，將所得溶液加入平衡好的金屬螯合親和柱頂端，用pH值4.1～4.9的0.015～0.025mol/L檸檬酸緩沖液進行洗脫，收集含有蛋白質的洗脫液；至洗脫液中檢測不到蛋白質時，停止收集；

4)取步驟3)所得洗脫液，濃縮，冷凍干燥，即得抗氧化酶。

本發明所述步驟1)中，所述血液為哺乳動物的血液，從血液中分離血紅細胞的方法為生物領域常規方法；分離得到的血紅細胞與水的體積比優選為1:0.5～2；破碎血紅細胞使用的裝置優選為閃式提取器，所述閃式提取器為本領域用于提取的常規閃式提取器，也可以由本領域其它可以實現本發明所述提取效果的儀器或方法代替，其操作參數為：在3000～8000rpm條件下提取，每次提取20～45s，共提取2～5次，每次間隔1～2min，提取參數優選為在5000rpm條件下提取、每次提取30s、共提取3次、每次間隔2min；所述氯仿體積優選為血紅細胞體積的0.1～0.2倍，95％乙醇體積優選為血紅細胞體積的0.1～0.3倍；所述萃取具體為：在500～700rpm條件下攪拌5～15min，優選為在600rpm條件下攪拌10min，再在3000～3200rpm條件下離心5～15min，優選為在3000rpm條件下離心15min。

本發明所述步驟1)所述硫酸銨沉淀，應將上層溶液中的酶充分沉淀下來，可以沉淀一次，優選為兩次；當采用兩次沉淀法時，包括以下步驟：將硫酸銨以質量體積比0.3～0.5:1溶解于上層溶液中，此處硫酸銨的質量單位為g，上層溶液的體積單位為ml，靜置20～40min，在0～4℃、7500～8500rpm條件下離心10～20min，分離上清液，收集沉淀；在所得上清液中以質量體積比0.7～0.9:1加入硫酸銨，此處硫酸銨的質量單位為g，上清液的體積單位為ml，靜置20～40min，在0～4℃、8500～9500rpm條件下離心25～35min，收集沉淀；將兩次收集所得的沉淀合并。