[發明專利]一種從血液中提取的抗氧化酶

在審

• 申請號: 201410851259.7
• 申請日: 2014-12-31
• 公開（公告）號: CN104560904A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 陳光;胡少雄;盛美田
• 申請（專利權）人: 唯美度科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;A61K8/66;A61Q19/08
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種從血液中提取的抗氧化酶，其特征在于，所述抗氧化酶由包括以下步驟的方法制備而成：

1)從血液中分離出血紅細胞，將洗凈后的血紅細胞與水混合，破碎血紅細胞得提取液，在所得提取液中加入氯仿和95％乙醇混合溶劑萃取，取上層溶液，加入硫酸銨靜置、離心、收集沉淀；

2)將步驟1)所得沉淀溶解于pH7.3～7.5的0.01～0.02mol/L磷酸鹽緩沖液中，將所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝膠柱Sephadex?G-25頂端，用本步驟所述磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收集含有蛋白質且不含硫酸銨的洗脫液，濃縮，得濃縮液；

3)在步驟2)所得濃縮液中加入NaCl，得到NaCl濃度為0.4～0.6mol/L的溶液，將所得溶液加入平衡好的金屬螯合親和柱頂端，用pH值4.1～4.9的0.015～0.025mol/L檸檬酸緩沖液進行洗脫，收集含有蛋白質的洗脫液；至洗脫液中檢測不到蛋白質時，停止收集；

4)將步驟3)所得洗脫液濃縮冷凍干燥，即得抗氧化酶。

2.根據權利要求1所述的從血液中提取的抗氧化酶，其特征在于，步驟1)所述破碎血紅細胞的裝置為閃式提取器，其操作參數為：在3000～8000rpm條件下提取，每次提取20～45s，共提取2～5次，每次間隔1～2min。

3.根據權利要求1或2所述的從血液中提取的抗氧化酶，其特征在于，步驟1)所述萃取具體為：在500～700rpm條件下攪拌5～15min，再在3000～3200rpm條件下離心5～15min。

4.根據權利要求1所述的從血液中提取的抗氧化酶，其特征在于，步驟1)所述加入硫酸銨靜置、離心、收集沉淀具體為：將硫酸銨以質量體積比0.3～0.5:1溶解于步驟1)所得粗酶液中，靜置20～40min，在0～4℃、7500～8500rpm條件下離心10～20min，分離上清液，收集沉淀；將硫酸銨以質量體積比0.7～0.9:1加入所得上清液中，靜置20～40min，在0～4℃、8500～9500rpm條件下離心25～35min，收集沉淀；將兩次收集所得的沉淀合并。

5.根據權利要求1所述的從血液中提取的抗氧化酶，其特征在于，步驟2)所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.015mol/L，pH值為6.8。

6.根據權利要求1所述的從血液中提取的抗氧化酶，其特征在于，步驟3)所述檸檬酸緩沖液的濃度為0.02mol/L，pH值為4.5。

7.根據權利要求1所述的從血液中提取的抗氧化酶，其特征在于，由包括以下步驟的方法制備而成：

1)從血液中分離出血紅細胞，將洗凈后的血紅細胞與水以體積比1:0.5～2混合，用閃式提取器破碎血紅細胞，其操作參數為：在3000～8000rpm條件下提取，每次提取20～45s，共提取2～5次，每次間隔1～2min；在所得提取液中加入血紅細胞體積0.1～0.2倍的氯仿和血紅細胞體積0.1～0.3倍的95％乙醇組成的混合溶劑，在500～700rpm條件下攪拌5～15min，再在3000～3200rpm條件下離心5～15min，取上層溶液；將硫酸銨以質量體積比0.3～0.5:1溶解于上層溶液中，靜置20～40min，在0～4℃、7500～8500rpm條件下離心10～20min，分離上清液，收集沉淀；將硫酸銨以質量體積比0.7～0.9:1加入所得上清液中，靜置20～40min，在0～4℃、8500～9500rpm條件下離心25～35min，收集沉淀；將兩次收集所得的沉淀合并；

2)將步驟1)所得沉淀以質量體積比1:1～5溶解于pH7.3～7.5的0.01～0.02mol/L磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖液中，將所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝膠柱Sephadex?G-25頂端，用本步驟所述磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收集含有蛋白質且不含硫酸銨的洗脫液，用PEG4000濃縮，得濃縮液；

3)在步驟2)所得濃縮液中加入NaCl，得到NaCl濃度為0.4～0.6mol/L的溶液，將所得溶液加入平衡好的金屬螯合親和柱頂端，用pH值4.1～4.9的0.015～0.025mol/L檸檬酸緩沖液進行洗脫，收集含有蛋白質的洗脫液；至洗脫液中檢測不到蛋白質時，停止收集；

4)用PEG4000濃縮步驟3)所得含有蛋白質的洗脫液，冷凍干燥，即得抗氧化酶。