[發(fā)明專利]一種基于生物多樣性信息分離反硝化脫硫細菌的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410850374.2
• 申請日: 2014-12-31
• 公開（公告）號: CN104450592A
• 公開（公告）日: 2015-03-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王愛杰;馬曉丹;高靈芳;遠野;黃聰;譚文博;趙友康;陳川
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 侯靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于環(huán)境微生物學(xué)領(lǐng)域，涉及反硝化脫硫細菌的篩選方法。

背景技術(shù)

近年來，隨著我國化工、制藥、食品加工、石油精煉等行業(yè)的迅速發(fā)展，高濃度、難降解有機廢水排放量逐年增多。其中，相當(dāng)一部分是含硫含氮有機廢水。此類廢水中含硫含氮化合物濃度高、毒性大、污染重、嚴重威脅環(huán)境和人體健康，成為導(dǎo)致我國水體災(zāi)難性生態(tài)破壞的主要污染源之一。目前，此類廢水處理普遍存在著“適用性處理技術(shù)缺乏、工藝系統(tǒng)復(fù)雜、工程投資巨大、運行成本高昂、達標(biāo)排放困難”等問題，尤其是硫系物難以有效去除導(dǎo)致的環(huán)境污染隱患更為突出。因此，治理含硫含氮有機廢水，遏制其對水體環(huán)境的惡劣影響對生態(tài)安全和社會經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展意義重大。

生物法普遍用于治理含硫含氮有機廢水。將硫系污染物轉(zhuǎn)化為生物硫的過程可以強化氮、硫去除，并徹底消除含硫化合物的環(huán)境隱患。在上個世紀(jì)70年代，Bisogni等人利用富集培養(yǎng)的脫氮硫桿菌進行了小試的自養(yǎng)反硝化實驗，以硫代硫酸鹽和硫化物作為電子供體，實驗結(jié)果顯示：在厭氧條件下，脫氮硫桿菌能夠以硝酸鹽作為電子受體并獲得能量。此后，國內(nèi)外報道了大量的關(guān)于自養(yǎng)脫硫反硝化細菌的研究工作。2004年，王愛杰、杜大仲等人分離篩選出了一株自養(yǎng)的脫氮硫桿菌(Thiobacillus?denitrificans)，并利用它研究DSR工藝的可行性及影響因素。2006年，王愛杰等人從土壤中分離篩選出一株自養(yǎng)脫硫反硝化的細菌，屬于紅球菌屬(Rhodococcus?sp.)。2007年，陳川從已在EGSB反應(yīng)器中馴化了半年的顆粒污泥里分離篩選出一株高效反硝化脫硫異養(yǎng)菌株，屬于假單胞菌屬(Pseudomonas?sp.)，打破了只有自養(yǎng)反硝化菌才能在反硝化脫硫過程中累積單質(zhì)硫的傳統(tǒng)理念。同時，陳川等人提出了自養(yǎng)-異養(yǎng)微生物聯(lián)合反硝化脫硫的技術(shù)思路，大幅提高了污水處理負荷及對污染物的轉(zhuǎn)化率。傳統(tǒng)理論認為自養(yǎng)-異養(yǎng)微生物聯(lián)合反硝化脫硫系統(tǒng)中自養(yǎng)菌進行脫硫反硝化，但效率低下；異養(yǎng)菌只能起到去除有機物的作用。然而近年來我們在對反硝化脫硫研究中發(fā)現(xiàn)一類新的功能微生物：即一類能夠高效同步代謝有機物并進行脫硫反硝化的微生物。過去已有研究證實了在廢水反硝化脫硫處理過程中有兼性自養(yǎng)菌/異養(yǎng)菌群的存在，能夠在反硝化脫硫的同時還能將部分有機物去除。但是至今未有在以硫化物和有機物同時作為電子供體，以硝酸鹽作為電子受體的培養(yǎng)基中篩選得到這類菌株的報道。因此該功能微生物的獲得將提出新的反硝化脫硫機制，對廢水處理工藝中硫、氮、碳的同步脫除研究提供了新思路，同時也為生物脫硫脫氮處理工藝的開發(fā)與工程應(yīng)用提供了微生物學(xué)依據(jù)。然而，由于傳統(tǒng)的微生物篩選方法的盲目性以及篩選條件缺乏特異的針對性，難以在穩(wěn)定運行的反硝化脫硫系統(tǒng)中篩選到菌群豐度及空間生態(tài)分布不同的功能微生物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種反硝化脫硫菌的篩選方法，即基于高通量測序技術(shù)提供的生物多樣性信息制定針對不同菌屬的特異性的篩選方法。

本發(fā)明的一種基于生物多樣性信息分離反硝化脫硫細菌的方法，它是按照以下步驟進行的：

一、從穩(wěn)定運行的進行生物脫硫脫氮的膨脹顆粒污泥床反應(yīng)器采集污泥樣品；

二、采用的高通量測序技術(shù)對污泥樣品進行群落空間結(jié)構(gòu)與豐度分析，獲得生物學(xué)多樣性信息；其中，所述的生物學(xué)多樣性信息是指：菌群豐度波動和空間生態(tài)分布信息；同時將步驟一中采集的污泥按體積比為1:5的比例加入無菌水，同時放入玻璃珠，在轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分鐘的條件下振蕩培養(yǎng)24小時，得各菌屬的懸液；

三、對步驟二各菌屬的菌液稀釋后，涂布于與各菌屬對應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，然后在其上澆蓋與該菌屬對應(yīng)的固體培養(yǎng)基，制成各菌屬的厭氧夾層培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱溫度為30℃的條件下進行厭氧培養(yǎng)至培養(yǎng)基夾層中產(chǎn)生氣泡；

四、剝離步驟三中各菌屬的厭氧夾層培養(yǎng)基的覆蓋部分，挑取氣泡內(nèi)的各菌屬的單菌落，轉(zhuǎn)入各菌屬對應(yīng)的液態(tài)分離培養(yǎng)基中，進行擴大培養(yǎng)，在恒溫培養(yǎng)箱30℃，培養(yǎng)周期為14天；

五、取步驟四培養(yǎng)后各菌屬的菌液，在各菌屬對應(yīng)的固體培養(yǎng)基上進行平板劃線培養(yǎng)；然后置于恒溫培養(yǎng)箱中，在30℃條件下進行培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，挑取各菌屬的單菌落轉(zhuǎn)入各菌屬對應(yīng)的液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；