[發明專利]一種試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201410848119.4
• 申請日: 2014-12-31
• 公開（公告）號: CN104531902A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 田克恭;李春歌
• 申請（專利權）人: 洛陽普萊柯萬泰生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 北京華夏正合知識產權代理事務所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

技術領域

本發明涉及一種試劑盒，具體涉及一種豬流行性腹瀉病毒檢測試劑盒及其制備方法。

背景技術

豬流行性腹瀉(porcine?epidemic?diarrhoea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine?epidemic?diarrhea?virus,PEDV)引起的以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染病，該病于1971年首次報道于荷蘭，我國于1976年發現本病。PEDV破壞感染豬空腸和回腸上皮細胞和腸絨毛，導致腹瀉，引起仔豬死亡，從而造成養豬業嚴重的經濟損失。特別是2010年以來，PEDV在亞洲主要養豬國家和美國呈現大規模爆發。

PEDV基因組是單股正鏈的RNA，全長27000-33000個核苷酸(nt)，基因組序列包含6個ORF，從5`→3`依次為編碼復制酶多聚蛋白、纖突蛋白(S)、ORF3蛋白、次要嵌膜蛋白(E)、主要嵌膜蛋白(M)和核衣殼蛋白(N)的基因。

研究人員針對PEDV臨床流行毒株設計了PCR擴增引物和相關的檢測方法，包括：(1)針對PEDV的N蛋白的保守區設計的引物而進行PEDV的通用檢測方法，但不能區分PEDV經典株和近年來流行的變異株(郭容利,何孔旺,倪艷秀等.PEDV、TGEV、PARV多重RT-PCR檢測方法的建立及其應用[J].江蘇農業學報,2013,29(5):1065-1069)；(2)通過PCR擴增樣品中PEDV的高變異區域而后通過測序鑒定是否是PEDV經典株或變異株，耗時長且費力，操作繁瑣。

專利申請CN103060474A公開了通過設計特異性引物對豬流行性腹瀉病毒變異株的S基因進行擴增，通過擴增片段的分子量大小，判斷是否存在豬流行性腹瀉病毒變異株。然而該方法不能滿足臨床針對豬流行性腹瀉病毒經典株和變異株的通檢，只能擴增變異株豬流行性腹瀉病毒，臨床應用需要利用其他的檢測方法檢測豬流行性腹瀉病毒經典株，程序繁瑣。

專利申請CN103805712A公開了通過針對豬流行性腹瀉病毒基因組保守區設計一對特異性引物，可以對豬流行性腹瀉病毒基因組模板進行特異性擴增，以此檢測豬流行性腹瀉病毒的存在。然而該發明不能夠區分近年來臨床上流行的變異的豬流行性腹瀉病毒和經典的豬流行性腹瀉病毒，不利于在分子生物學水平上快速檢測區分臨床樣品中豬流行性腹瀉病毒。

發明內容

為解決現有技術的不足，本發明提供了一種快速檢測豬流行性腹瀉病毒的試劑盒，不僅滿足了區分豬流行性腹瀉病毒經典株和變異株的現實需求，能簡單、快捷、有效地針對豬流行性腹瀉病毒進行毒株差異鑒定，同時還實現了不漏檢臨床樣品中的豬流行性腹瀉病毒的目的，同時簡化了豬流行性腹瀉病毒經典株和變異株的鑒定時間和程序。

本發明的第一方面在于提供一種試劑盒，所述試劑盒包括能擴增PEDV?S1蛋白基因中包含5`端啟動子前第28位核苷酸至啟動子后第532位核苷酸的核苷酸序列的上、下游引物，以及Pst?I限制性內切酶。

術語“PEDV?S1蛋白”即為“豬流行性腹瀉病毒S1蛋白”，位于豬流行性腹瀉病毒S蛋白的功能區之一，由789個氨基酸組成(參見豬流行性腹瀉病毒S1蛋白截短表達及多抗制備，任曉峰，賈文龍，東北農業大學學報,2013,44(9):46-50)。

作為本發明的一種實施方式，本發明的試劑盒中，所述上游引物為SEQ?ID?NO.2編碼的核苷酸序列，下游引物為SEQ?ID?NO.3編碼的核苷酸序列。

上述引物設計參考CV777毒株全基因組序列，CV777毒株GenBank登錄號為AF353511。

優選地，所述試劑盒中PCR反應液包括序列為SEQ?ID?NO.2的上游引物，序列為SEQ?ID?NO.3的下游引物，或包含所述引物序列擴增相同基因序列的核苷酸引物序列；更優選地，所述試劑盒中PCR反應液中的上游引物、下游引物各50μl。

作為本發明的一種實施方式，所述試劑盒進一步包含PCR反應體系和限制性酶切反應體系；其中，所述PCR反應體系包括dNTPs、DNA聚合酶、Mg²⁺、反轉錄酶、RNA酶抑制劑、穩定劑；以及所述限制性酶切反應體系包括Pst?I酶切緩沖液、雙蒸水。

所述穩定劑用于穩定DNA聚合酶的活性，主要成分包括甘油、山梨醇、甘露醇、肌醇、PEG等。