[發明專利]柱狀黃桿菌選擇性培養基及利用其分離純化柱狀黃桿菌的方法

有效

• 申請號: 201410845838.0
• 申請日: 2014-12-31
• 公開（公告）號: CN104651266A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 周偉東;林蠡;張玉蕾;鄧俊杰;譚銳敏;艾桃山;姬偉;周洋;劉小玲;袁改玲
• 申請（專利權）人: 武漢市水產科學研究所;華中農業大學;深圳市鴻鵠科技發展有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/20
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 喬宇

技術領域

本發明屬于微生物培養技術，具體涉及到新的柱狀黃桿菌選擇性培養基及利用其分離純化柱狀黃桿菌的方法。

背景技術

柱狀黃桿菌(Flavobacterium?columnare)隸屬于擬桿菌門、黃桿菌綱、黃桿菌目、黃桿菌科，是革蘭氏陰性的能滑動的需氧桿菌。它是一種世界范圍內流行的淡水魚類的重要致病菌，其感染會導致魚類出現爛鰓、體表潰瘍、鰭條腐爛、出血等癥狀，稱為柱形病。柱狀黃桿菌嚴重危害我國重要經濟魚類，如草魚、青魚、鱖、鯉、鯽、團頭魴、鰻鱺、巨脂鯉、銀鱸、鮭、鱒、白鯧、羅非魚等。被感染的魚類具有很高的死亡率，給漁業生產帶來數以億計的巨大經濟損失，是我國重要的魚類病原菌。我國很重視柱狀黃桿菌的研究，目前主要集中細菌的快速鑒定和疫苗研發。如“一種檢測無鱗魚致病菌柱狀黃菌的方法和檢測試劑盒”（申請號：CN201010180832）。此專利采用PCR技術鑒定菌種，沒有涉及到選擇性培養基配方和柱狀黃桿菌的分離純化方法。“柱狀黃桿菌基因重組疫苗的制備方法”（申請號：CN201310478221）。此專利為柱狀黃桿菌基因重組疫苗制備方法，也沒有涉及到選擇性培養基配方和柱狀黃桿菌的分離純化方法。

在魚類疾病的研究中，快速分離病原菌是從事疾病研究的首要環節。但是，目前還缺乏快速分離該菌的選擇性培養基。在病原菌的分離過程中，只要有一個雜菌的存在，就會導致整個細菌分離的失敗。因此，開展細菌的純化技術研究是必須的。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種柱狀黃桿菌選擇性培養基及利用其分離純化柱狀黃桿菌的方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下：

柱狀黃桿菌選擇性培養基，其特征在于：它是在柱狀黃桿菌常規培養基滅菌冷卻后加入托普霉素使其終濃度為2?μg/mL、多粘菌素B使其終濃度為20?U/mL，倒平板而得到的柱狀黃桿菌選擇性固體培養基；

或為在柱狀黃桿菌常規培養基的配方中去除瓊脂，滅菌冷卻后加入托普霉素使其終濃度為2?μg/mL、多粘菌素B使其終濃度為20?U/mL而得到的柱狀黃桿菌選擇性液體培養基。

按上述方案，所述的柱狀黃桿菌常規培養基為常規Shieh固體培養基。

按上述方案，所述的常規Shieh固體培養基為：稱取蛋白胨5?g、酵母提取物0.5?g、Noble瓊脂10?g?、K₂HPO₄?0.1?g、KH₂PO₄?0.05?g、乙酸鈉0.01?g、NaHCO₃?0.05?g、MgSO₄·7H₂O?0.3?g、BaCl₂·H₂O?0.01?g、FeSO₄·7H₂O?0.001?g、CaCl₂·2H₂O?0.0067?g加入到1000?mL蒸餾水中，調pH至7.2，滅菌而得。

按上述方案，所述的滅菌溫度120℃，滅菌時間為20min。

本發明所要解決的技術問題之二是提供一種利用上述柱狀黃桿菌選擇性培養基分離純化柱狀黃桿菌的方法，步驟如下：

1）、在魚類病灶上，采用無菌操作，將細菌通過劃平板法接種到柱狀黃桿菌常規固體培養基上進行培養，至培養基上觀察到柱狀黃桿菌的典型黃色菌落；

2）、挑選上述步驟培養得到的單一黃色菌落，劃線接種到柱狀黃桿菌選擇性固體培養基上，進行培養

3）、挑選上述步驟培養得到的單一黃色菌落，再次接種到柱狀黃桿菌選擇性液體培養基上，進行培養；

4）將上述步驟培養得到的黃色菌液按照10倍系列稀釋，均勻涂布到狀黃桿菌選擇性固體培養基上，進行培養；

5）挑選最低稀釋倍數出現細菌的平板上的單一黃色菌落，接種到柱狀黃桿菌選擇性液體培養基上，進行培養，然后經確證為純的柱狀黃桿菌菌種后，進行低溫保存或干燥保存，即得分離純化后的柱狀黃桿菌。

按上述方案，所述的培養為26-28℃培養24-26小時。

按上述方案，所述步驟4）中進行10倍系列稀釋后得到稀釋度為10^-5~10^-8的體系。

按上述方案，在進行一次選擇分離后未能得到純的柱狀黃桿菌后，再重復步驟2）到步驟5），直到獲得純的柱狀黃桿菌菌種。