[發明專利]一種產低溫中性蛋白酶菌株的篩選方法

無效

• 申請號: 201410845331.5
• 申請日: 2014-12-31
• 公開（公告）號: CN104561238A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 錢利純;閆豐英;張曉旭
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;C12Q1/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 邱啟旺

技術領域

本發明涉及一種產酶微生物的篩選方法，尤其涉及一種從深海淤泥中篩選得到產低溫中性蛋白酶的菌株的方法。

技術背景

深海環境由于終年低溫，存在一個低溫的生態系統，包括多種低溫動物和微生物。深海低溫微生物經過長期的進化適應，有著適應低溫環境的特殊結構與代謝機制，他們產生的酶在低溫環境下有著比中溫酶更高的催化效率，從而能夠大幅度節約能源，在食品、洗滌劑、化妝品和水產飼料等工業上，有著較高的開發利用價值。蛋白酶是目前應用最多的一種酶，但所用的基本是中溫酶，其最適酶活溫度在50℃左右，而低溫蛋白酶的最適酶活溫度基本都在40℃以下，而且酶的最適產酶溫度都在25℃左右。世界上也有相關實驗室從事低溫蛋白酶的研究，目前已從海水、嗜冷的魚類和貝類以及高山、南北極泥土等樣品中分離到產低溫蛋白酶的菌株。有關深海微生物資源的勘探和代謝活性物質研究，已成為國際上極端微生物研究的熱點之一，我國的一些研究機構也積極開展低溫蛋白酶生產菌株的篩選工作。

微生物篩選時由于采集樣品中的微生物數量較少，通常通過富集培養增加目標微生物的數量，但富集后樣品中微生物多樣性降低，富集培養效果不一致，呈現極好極壞兩極化狀態。本發明中將菌液濃縮，從而增加單位體積內微生物數量，確保篩選效果。同時，在培養基制備時投其所好，將海洋淤泥的上清液滅菌后代替雙蒸水制備培養基，確保菌株的正常生長。

發明內容

本發明的目的是提供一種成本低、易實施、效果好的從深海淤泥中篩選產低溫中性蛋白酶菌種的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種產低溫中性蛋白酶菌株的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）制備上清液：將深海淤泥加到質量百分比為0.85%的生理鹽水中，深海淤泥和生理鹽水的體積比為1:10~20，得到第一懸浮液；漏斗過濾后再使用真空抽濾器過濾，得到的上清液經121℃高溫蒸汽滅菌15min；

（2）制備初篩培養基、斜面培養基和發酵培養基；以質量比計，初篩培養基中包括2.0%的干酪素和1.5%的瓊脂，余量為步驟1制備的上清液，pH為7.0；斜面培養基中包括1.0%的胰蛋白胨、0.5%的酵母膏、1.0%的NaCl和1.5%的瓊脂，余量為步驟1制備的上清液，pH為7.0；發酵培養基中包括4.0%的麩皮、0.1%的蛋白胨、0.4%的Na₂HPO₄·12H₂O和0.03%的KH₂PO₄，余量為步驟1制備的上清液，pH為7.0；

（3）菌液濃縮：將深海淤泥加到質量百分比為0.85%的生理鹽水中，深海淤泥和生理鹽水的體積比為1:5~10，得到第二懸浮液，使用漏斗過濾，得到的上清液置于18~22℃培養箱中培養4~6小時，得到濃縮后的菌液；

（4）菌株初篩：將步驟3濃縮后的菌液加到質量百分比為0.85%的無菌生理鹽水中，按照10倍梯度稀釋法稀釋6次，分別取各稀釋梯度的菌液置于步驟2制備的初篩培養基中，20~25℃下培養24~72小時；挑取透明圈大的菌株，在步驟2中制備的斜面培養基中保存；

（5）菌種復篩：將初篩得到的菌種按體積比1%的接種量接種到發酵培養基中，20℃，200rpm培養48h；得到的發酵液在8000r/min冷凍離心機中4℃離心15min，得到上清液即為粗酶液；以干酪素為底物，用福林酚法測定粗酶液酶活，進一步挑選出產酶能力強的菌株。

????本發明的有益效果是，本發明的方法通過對培養基改良，在培養基中添加海洋天然物質，對樣品濃縮以增加單位體積微生物含量以及控制篩選條件等途徑，從我國東海海域約600m水深獲得的海洋淤泥中篩選得到產低溫中性蛋白酶菌株，最高粗酶酶活達35.5U/ml。

具體實施方式

實施例1

初篩培養基制備：將取自深海的淤泥10g加到100ml雙蒸水中制成懸浮液，搖勻。先使用漏斗過濾再使用真空抽濾器過濾。將上清液經121℃高壓蒸汽滅菌15min后替代雙蒸水用于制備培養基。初篩培養基：干酪素2.0%，瓊脂1.5%，pH?7.0。斜面培養基：胰蛋白胨1.0%，酵母膏0.5%，NaCl?1.0%，瓊脂1.5%，pH?7.0。發酵培養基：麩皮4.0%，蛋白胨0.1%，Na₂HPO₄·12H₂O0.4%，KH₂PO₄0.03%，pH7.0。