[發(fā)明專利]一種產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株的篩選方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410845331.5
• 申請日: 2014-12-31
• 公開（公告）號: CN104561238A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 錢利純;閆豐英;張曉旭
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/37
• 分類號: C12Q1/37;C12Q1/04
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 邱啟旺

1.一種產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）制備上清液：將深海淤泥加到質(zhì)量百分比為0.85%的生理鹽水中，深海淤泥和生理鹽水的體積比為1:10~20，得到第一懸浮液；漏斗過濾后再使用真空抽濾器過濾，得到的上清液經(jīng)121℃高溫蒸汽滅菌15min；

（2）制備初篩培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基；以質(zhì)量比計(jì)，初篩培養(yǎng)基中包括2.0%的干酪素和1.5%的瓊脂，余量為步驟1制備的上清液，pH為7.0；斜面培養(yǎng)基中包括1.0%的胰蛋白胨、0.5%的酵母膏、1.0%的NaCl和1.5%的瓊脂，余量為步驟1制備的上清液，pH為7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基中包括4.0%的麩皮、0.1%的蛋白胨、0.4%的Na₂HPO₄·12H₂O和0.03%的KH₂PO₄，余量為步驟1制備的上清液，pH為7.0；

（3）菌液濃縮：將深海淤泥加到質(zhì)量百分比為0.85%的生理鹽水中，深海淤泥和生理鹽水的體積比為1:5~10，得到第二懸浮液，使用漏斗過濾，得到的上清液置于18~22℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4~6小時(shí)，得到濃縮后的菌液；

（4）菌株初篩：將步驟3濃縮后的菌液加到質(zhì)量百分比為0.85%的無菌生理鹽水中，按照10倍梯度稀釋法稀釋6次，分別取各稀釋梯度的菌液置于步驟2制備的初篩培養(yǎng)基中，20~25℃下培養(yǎng)24~72小時(shí)；挑取透明圈大的菌株，在步驟2中制備的斜面培養(yǎng)基中保存；

（5）菌種復(fù)篩：將初篩得到的菌種按體積比1%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，20℃，200rpm培養(yǎng)48h；得到的發(fā)酵液在8000r/min冷凍離心機(jī)中4℃離心15min，得到上清液即為粗酶液；以干酪素為底物，用福林酚法測定粗酶液酶活，進(jìn)一步挑選出產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株。