[發明專利]一種非諾特羅的膠體金檢測卡及其制備方法

有效

• 申請號: 201410844525.3
• 申請日: 2014-12-30
• 公開（公告）號: CN104569408A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 徐波;熊勇華;劉春梅;李林;楊曉慧
• 申請（專利權）人: 無錫中德伯爾生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟;楊晞

1.一種非諾特羅的膠體金檢測卡，其特征在于：包括卡殼及設置于卡殼內的試紙條，所述試紙條上沿液體流動方向依次設置有樣本墊、金標結合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，所述金標結合物墊上包被有抗非諾特羅單克隆抗體-膠體金結合物，所述抗非諾特羅單克隆抗體-膠體金結合物中的抗非諾特羅單克隆抗體是以非諾特羅偶聯抗原Ⅰ為免疫抗原制備的，所述硝酸纖維素膜上鄰近金標結合物墊的一端設置有檢測線，且硝酸纖維素膜上鄰近吸水墊的一端設置有質控線，所述檢測線上包被有非諾特羅偶聯抗原Ⅱ，所述質控線上包被有抗鼠二抗。

2.根據權利要求1所述的非諾特羅的膠體金檢測卡，其特征在于：所述卡殼由底卡及面卡構成，且卡殼由塑料材料制成。

3.根據權利要求2所述的非諾特羅的膠體金檢測卡，其特征在于：所述面卡上開有加樣孔，所述加樣孔位于樣本墊的上方。

4.根據權利要求2所述的非諾特羅的膠體金檢測卡，其特征在于：所述面卡上開有觀察窗，所述觀察窗位于硝酸纖維素膜的上方。

5.一種非諾特羅的膠體金檢測卡制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

一、金標結合物墊的制備：

a、合成非諾特羅偶聯抗原Ⅰ：取載體蛋白，用雙蒸水溶解后，再用NaOH調pH至10，加入1,4-丁二醇二縮水甘油醚，在氮氣保護下，避光攪拌24小時，通過柱層析純化制得接臂載體蛋白，所述1,4-丁二醇二縮水甘油醚與蛋白載體的摩爾比為100：1，將非諾特羅調成堿性后，在攪拌條件下緩慢加入到接臂載體蛋白中，氮氣保護下室溫避光攪拌24小時，反應產物在4℃用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液透析3天，透析后得到非諾特羅偶聯抗原Ⅰ；

b、免疫動物：將上述步驟a中制成的非諾特羅偶聯抗原Ⅰ與等量弗氏完全佐劑乳化完全后，免疫小鼠；

c、細胞融合和雜交瘤細胞篩選：取經非諾特羅偶聯抗原Ⅰ免疫的小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，并采用HAT培養基進行培養，對培養上清進行檢測，篩選獲得穩定分泌抗非諾特羅單克隆抗體的細胞株14F8-B3-C9；

d、制備腹水：將分泌抗非諾特羅單克隆抗體的細胞株14F8-B3-C9培養后，注射入BALB/C小鼠腹腔，收集其腹水；

e、抗非諾特羅單克隆抗體的純化制備：采用硫酸銨沉淀法對腹水進行透析、過濾處理，采用非諾特羅親和層析柱對經透析、過濾處理的上清進行純化，提純制備出抗非諾特羅單克隆抗體；

f、膠體金溶液制備：在超純水中加入1％氯金酸，加熱煮沸，迅速加入1％檸檬酸三鈉，繼續煮沸15分鐘，所述超純水、氯金酸、檸檬酸三鈉的體積比為99：1：1，冷卻后用超純水恢復至原來的體積，4℃保存備用；

g、抗非諾特羅單克隆抗體-膠體金結合物溶液的制備：將膠體金溶液調pH至6.0后，用20μg/mL濃度的抗非諾特羅單克隆抗體反應1小時，然后用10％牛血清白蛋白進行封閉，4℃?7500g離心30分鐘，去上清，膠體金沉淀用1/10膠體金體積的金標復溶液進行溶解，制成抗非諾特羅單克隆抗體-膠體金結合物溶液，所述膠體金溶液、抗非諾特羅單克隆抗體、牛血清白蛋白的體積比為100：10：5；

h、制備金標結合物墊：將上述制備的抗非諾特羅單克隆抗體-膠體金結合物溶液以4μL/cm噴量噴涂于結合物墊上，37度干燥3小時后，放于濕度低于20％的干燥柜保存備用；

二、硝酸纖維素膜的制備：

a、合成非諾特羅偶聯抗原Ⅱ：將對氨基苯甲酸、亞硝酸鈉溶于pH2.0的溶液中，在冰浴和避光條件下磁力攪拌反應4小時，制得重氮鹽，所述對氨基苯甲酸、亞硝酸鈉的質量比為1：2，將該重氮鹽與非諾特羅反應，生成非諾特羅衍生物，產物經柱層析純化，將純化后的非諾特羅衍生物與載體蛋白按摩爾比50:1，采用EDC/NHS法合成非諾特羅偶聯抗原Ⅱ，然后在4℃用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液透析3天，得到純化的非諾特羅偶聯抗原Ⅱ；

b、制備硝酸纖維素膜：以0.01mol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液為稀釋液，將非諾特羅偶聯抗原Ⅱ稀釋至0.5mg/mL，并以1μL/cm噴量噴涂于硝酸纖維素膜的一端作為檢測線，將抗鼠二抗稀釋至1.0mg/mL，并以1μL/cm噴量噴涂于硝酸纖維素膜的另一端作為質控線，37℃干燥2小時后，密封，室溫保存備用；

三、非諾特羅的膠體金檢測卡的組裝：

在底板上依次粘貼樣本墊、金標結合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊從而組裝成試紙條，所述硝酸纖維素膜包被非諾特羅偶聯抗原Ⅱ的一端搭接金標結合物墊，且硝酸纖維素膜包被抗鼠二抗的一端搭接吸水墊，將試紙條剪切成一定寬度后裝于卡殼中。