[發(fā)明專利]一種非諾特羅的膠體金檢測卡及其制備方法

有效

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• 申請日: 2014-12-30
• 公開（公告）號: CN104569408A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發(fā)明（設計）人: 徐波;熊勇華;劉春梅;李林;楊曉慧
• 申請（專利權）人: 無錫中德伯爾生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/558
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟;楊晞

技術領域

本發(fā)明涉及食品安全檢測領域，尤其涉及一種非諾特羅的膠體金檢測卡及其制備方法。

背景技術

非諾特羅，屬于選擇性β2型受體激動劑，它可用于治療支氣管哮喘，尤其對兒童支氣管哮喘有較好的療效。β2型受體激動劑種類較多，其它有鹽酸克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、西布特羅、馬布特羅、溴布特羅、妥布特羅、氯丙那林、班布特羅等。在畜牧養(yǎng)殖中，有少部分人將鹽酸克侖特羅等β2型受體激動劑作為一種生長促進劑非法添加到飼料中，用以改善胴體的品質，但同時也造成食品中β2型受體激動劑的殘留。當人們食用殘留量大的食品后可能會出現一系列的中毒癥狀。我國已明令禁止在畜牧業(yè)中使用鹽酸克侖特羅，沙丁胺醇等β2型受體激動劑。

免疫層析技術是出現于80年代初期，通常以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品在層析條上爬動，層析材料上的受體(如抗體或抗原)與樣品中的待測物發(fā)生特異性免疫反應而顯色。免疫層析技術常見的示蹤粒子有膠體金、乳膠、膠體硒、明膠等，其中運用最成功的標記物為膠體金。用膠體金作為特殊標記物的研究始于60年代初，1962年Feldberr等報道了用膠體金標記細胞進行電子顯微鏡的研究。1971年，Taylor等將膠體金引入電鏡免疫標記技術中。90年代以來，由于早孕試紙條的快速推廣和使用，使得膠體金檢測卡成為開發(fā)最多，使用最廣，最為成熟的體外診斷試劑。

目前，用于檢測非諾特羅公開報道的方法和標準較多：如農業(yè)部標準《動物源性食品中β-受體激動劑殘留檢測液相色譜－串聯質譜法》(1025號公告-18-2008)，非諾特羅檢測限可達0.25μg/kg；遼寧省地方標準《牛羊組織中β-受體激動劑殘留檢測超高效液相色譜-串聯質譜法》(DB?21/3004—2013)，非諾特羅檢測限可達0.25μg/kg；吉林省地方標準《動物源性食品中24種受體激動劑殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》(DBS22?012-2013)，非諾特羅檢測限可達0.1μg/kg；然而用于檢測非諾特羅的產品鮮有報道，中國專利文獻公開號CN102359961A的專利，公開了一種用于β-腎上腺素受體激動劑類化合物檢測的試劑盒，該方法是通過比較樣品溶液與空白溶液的變色時間來定性檢測非諾特羅，其存在靈敏度低，準確性差，不能定性檢測非諾特羅等問題。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于針對上述問題，提供一種非諾特羅的膠體金檢測卡及其制備方法，其具有成本低、靈敏度高、檢測方便、快捷的特點。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現：

一種非諾特羅的膠體金檢測卡，包括卡殼及設置于卡殼內的試紙條，所述試紙條上沿液體流動方向依次設置有樣本墊、金標結合物墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，所述金標結合物墊上包被有抗非諾特羅單克隆抗體-膠體金結合物，所述抗非諾特羅單克隆抗體-膠體金結合物中的抗非諾特羅單克隆抗體是以非諾特羅偶聯抗原Ⅰ為免疫抗原制備的，所述硝酸纖維素膜上鄰近金標結合物墊的一端設置有檢測線，且硝酸纖維素膜上鄰近吸水墊的一端設置有質控線，所述檢測線上包被有非諾特羅偶聯抗原Ⅱ，所述質控線上包被有抗鼠二抗。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述卡殼由底卡及面卡構成，且卡殼由塑料材料制成。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述面卡上開有加樣孔，所述加樣孔位于樣本墊的上方。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，所述面卡上開有觀察窗，所述觀察窗位于硝酸纖維素膜的上方。

一種非諾特羅的膠體金檢測卡制備方法，包括以下步驟：

一、金標結合物墊的制備：

a、合成非諾特羅偶聯抗原Ⅰ：取載體蛋白，用雙蒸水溶解后，再用NaOH調pH至10，加入1,4-丁二醇二縮水甘油醚，在氮氣保護下，避光攪拌24小時，通過柱層析純化制得接臂載體蛋白，所述1,4-丁二醇二縮水甘油醚與蛋白載體的摩爾比為100：1，將非諾特羅調成堿性后，在攪拌條件下緩慢加入到接臂載體蛋白中，氮氣保護下室溫避光攪拌24小時，反應產物在4℃用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液透析3天，透析后得到非諾特羅偶聯抗原Ⅰ；

b、免疫動物：將上述步驟a中制成的非諾特羅偶聯抗原Ⅰ與等量弗氏完全佐劑乳化完全后，免疫小鼠；

c、細胞融合和雜交瘤細胞篩選：取經非諾特羅偶聯抗原Ⅰ免疫的小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，并采用HAT培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，對培養(yǎng)上清進行檢測，篩選獲得穩(wěn)定分泌抗非諾特羅單克隆抗體的細胞株14F8-B3-C9；

d、制備腹水：將分泌抗非諾特羅單克隆抗體的細胞株14F8-B3-C9培養(yǎng)后，注射入BALB/C小鼠腹腔，收集其腹水；