[發(fā)明專利]一種可用于肝衰竭治療的經HGF基因修飾的UCMSC制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410841610.4
• 申請日: 2014-12-29
• 公開（公告）號: CN104561099A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發(fā)明（設計）人: 唐云霞;李陶;胡祥;劉沐蕓
• 申請（專利權）人: 深圳市北科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;A61P1/16
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所(普通合伙) 44248
• 代理人: 孫偉

技術領域

本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及一種經HGF修飾的UCMSC制備方法。

背景技術

肝衰竭(Liver?Failure)是多種因素引起的嚴重肝臟損害，導致其合成、解毒、排泄和生物轉化等功能發(fā)生嚴重障礙或失代償，出現以凝血機能障礙和黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現的一組臨床癥候群。近些年來，由于肝衰竭死亡的人數逐漸增多，據統計，美國每年約有3?萬人死于肝功能衰竭，而我國每年死于此癥的患者約30?萬。急性肝衰竭是一種急性的嚴重肝功能障礙，其特點是起病急、病情危重、癥狀表現多樣、肝細胞廣泛壞死。目前治療肝衰竭的主要手段為:內科治療、肝移植和細胞治療等。內科治療療效有限，迄今為止尚未有對癥的特效藥。目前,?肝移植雖已成為治療終末期肝病的重要手段,?但供體短缺、?手術損傷、?免疫排斥以及費用高昂等問題構成了肝移植技術發(fā)展的主要障礙。?因此,?開展具有侵入性小,?并發(fā)癥少等特點的干細胞移植成為最近治療急性肝衰的研究熱點

干細胞是一種未分化的細胞，有兩個基本特征，一是自我復制能力，二是能分化成一種以上的功能細胞，根據分化潛能的大小，干細胞一般分成三類，第一類是全能干細胞即可以分類為功能一致的全能細胞。第二類是多潛能干細胞，它能分化成為身體中每種細胞類型，但是不能形成胎盤和胎兒發(fā)育所必須的支持組織。第三類是成體干細胞是一種將擁有終生自我復制或自我更新能力的干細胞。它分布于不同組織并可養(yǎng)生成為各種類型資質細胞。

間充質干細胞（mesenchymal?stem?cells,?MSCs）屬于成體干細胞，是一種具有自我復制能力和多向分化潛能的成體干細胞，屬于非終末分化細胞，可分化為脂肪、軟骨、骨、肌肉、肌腱、神經、肝、心肌、胰島β細胞和內皮等多種組織細胞。間充質干細胞由于免疫原性低，成體組織來源豐富（廣泛存在于人體的骨髓、脂肪組織、新生兒臍帶及胎盤等），易于分離，純度高，無腫瘤細胞污染；擴增時培養(yǎng)體系能統一，便于質控；可制成種子細胞冷凍，多次使用，冷凍后細胞損失??；潛伏性病毒和病原微生物的感染及傳播幾率比較低；采集時對產婦及新生兒無任何危害及損傷；采集方便，易于保存和運輸，倫理學爭議少。

目前不少研究證明干細胞在體外進過特殊培養(yǎng)均有分化成為肝細胞的能力。Burra?P證明造血干細胞可以體外培養(yǎng)可以分化成為肝細胞。?Lee?KD研究證明骨髓來源的間充質干細胞體外分化培養(yǎng)可以分化成肝細胞。目前大鼠、?小鼠和人的有關實驗模型,?提示骨髓來源細胞可以轉化為肝細胞。目前關于不同來源干細胞治療急性肝衰的報道也有很多。Maria?Cristina?Belardinelli證明單個核骨髓細胞能治療對乙?；被右鸬募毙愿嗡?。骨髓間充質干細胞治療急性肝衰的研究也有報道。有人得出結論，肝臟中某些部分損傷可能更適合用骨髓來源的干細胞進行修復。由于骨髓來源干細胞存在缺乏供體，不易獲取的缺點，限制了它的臨床應用。臍帶間細胞干性好?，分化能力強，免疫源性低等優(yōu)點。對于治療急性肝衰有很大的應用潛能。

研究發(fā)現，間充質干細胞是通過旁分泌機制行使對急性肝衰以及急性肝損傷的治療作用的。干細胞生長因子（hepatocyte?growth?factor）是細胞治療急性肝衰中，細胞旁分泌機制中起重要作用的一種細胞因子。

肝細胞生長因子HGF（hepatocyte?growth?factor）是存在于急性肝損傷動物血漿中的蛋白因子，它能刺激干細胞中DNA合成，且在肝再生過程中起到重要作用。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于根據干細胞治療急性肝衰最新研究成果，選擇一種來源廣泛，獲取容易，免疫原型低的間充質干細胞，臍帶間充質干細胞（UCMSC）來作為移植細胞。依據肝衰細胞治療作用的機制是通過細胞旁分泌作用完成的，以及肝生長因子（HGF）在肝衰中保護作用。采用腺病毒包裝肝生長因子的基因。用包裝了HGF基因的腺病毒去感染UCMSC，制備經過基因修飾過表達HGF的UCMSC。為急性肝衰以及其他肝臟疾病提供一種更加有效細胞治療產品。

本發(fā)明的目的的技術方案是：

經HGF基因修飾的UCMSC制備方法，包括步驟：

A）HGF基因的克隆；

B）含HGF目的基因的穿梭質粒制備；

C）含HGF的復制缺陷型腺病毒Ad-HGF的構建；

D）經過基因修飾過表達HGF的UCMSC的制備。