[發明專利]一種可用于肝衰竭治療的經HGF基因修飾的UCMSC制備方法

在審

• 申請號: 201410841610.4
• 申請日: 2014-12-29
• 公開（公告）號: CN104561099A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 唐云霞;李陶;胡祥;劉沐蕓
• 申請（專利權）人: 深圳市北科生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10;A61P1/16
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所(普通合伙) 44248
• 代理人: 孫偉

1.經HGF基因修飾的UCMSC制備方法，包括步驟：

A）HGF基因的克隆；

B）含HGF目的基因的穿梭質粒制備；

C）含HGF的復制缺陷型腺病毒Ad-HGF的構建；

D）經過基因修飾過表達HGF的UCMSC的制備。

2.如權利要求1所述的經HGF基因修飾的UCMSC制備方法，其特征是：所述步驟A）克隆HGF目的基因的引物對的核苷酸序列為：SEQ?ID?NO:2和SEQ?ID?NO:3所示，克隆到的HGF基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

3.如權利要求1所述的經HGF基因修飾的UCMSC制備方法，其特征是：步驟C）所述Ad-HGF的構建方法為：

將B）步驟所述穿梭質粒與腺病毒的骨架質粒pBHGdeletE1,3Cre/loxp共轉染293細胞，轉染的具體過程如下：

1）?將293細胞以1.5X105/孔鋪入24孔板中，培養過夜；

2）?混勻脂質體2000，取一定量加入Opti-MEM中，輕輕混勻；再取穿梭質粒pDC315-HGF和骨架質粒pBHGdeletE1,3Cre/loxp加入Opti-MEM中，輕輕混勻；然后將脂質體與質粒混合，室溫放置20分鐘；

3）?將將脂質體與質粒再次混勻，滴入孔中，輕輕晃動培養板，使之在孔內分布均勻；

4）、4小時后補加培養基；

5）、腺病毒穿梭質粒和骨架質粒在細胞內發生同源重組，待出現病毒空斑，構建出含HGF的復制缺陷型腺病毒Ad-HGF；

6）、通過有限稀釋法挑選出病毒單克隆，再從中篩選出滴度高的病毒毒株，大量擴增。

4.如權利要求1所述的經HGF基因修飾的UCMSC制備方法，其特征是：步驟D）所述UCMSC的制備方法為：用Ad-HGF感染UCMSC，隨著病毒感染并進入細胞，HGF基因也被導入UCMSC細胞中，隨著宿主細胞DNA的轉錄翻譯，目的基因HGF也得到轉錄復制，從而表達出HGF蛋白。

5.如權利要求4所述的經HGF基因修飾的UCMSC制備方法，其特征是：所述UCMSC的制備方法的具體操作步驟如下：

A1）?按照10⁶/?T175?flask鋪細胞；

?加入25~30ml?BK-M-A培養基；

每種細胞分為三組：?Ad-HGF,?Ad?Null,?對照；并配置BK-M-A培養基；

從兩瓶500ml?BK-M-A中各取20ml加入一瓶BK-F-03，混勻，至無可見固體，然后分裝到兩瓶500ml?BK-M-A中；

?每瓶培養基再各加入5ml的L-Gln，混勻；

A2）Ad-HGF,?Null?感染BM-MSC和UC-MSC細胞；

觀察細胞貼壁情況：若貼壁良好，生長正常，細胞狀態良好則進行腺病毒的感染；

根據細胞數計算所需腺病毒的量；

配置HP4并計算加入HP4的體積；

A3）取出細胞培養瓶，吸凈培養基；每瓶加入12~15ml的生理鹽水洗細胞；

吸棄生理鹽水，加入混合好的含有腺病毒的DMEM/F12；培養箱中靜置2-4小時感染；

A4）吸凈含有腺病毒的DMEM/F12，再用生理鹽水洗細胞；加入BK-M-A培養基繼續培養；

A5）用western?blot?的方法檢測導入了HGF的UCMSC中HGF蛋白的表達情況，以及將含HGF的UCMSC注射至小鼠體內，提取肝組織的總蛋白，檢測其中是否含有HGF。